從固定液保存的刺參樣品中提取基因組DNA的改進(jìn)方法

王祖哲　王利　顧晨雷　馬普　王秀利

刺參（Apostichopus japonicus）分類學(xué)上隸屬于棘皮動物門、游走亞門、海參綱、楯手目、刺參科，是重要的經(jīng)濟海參物種[1]。刺參含有豐富的蛋白質(zhì)、酸性黏多糖、維生素、氨基酸、海參皂苷以及多種微量元素和生理活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)、保健和藥用價值。其中以產(chǎn)于我國遼寧、山東沿海的刺參營養(yǎng)、藥用價值最高。隨著人們生活水平的提高，刺參市場需求量顯著增加。20世紀(jì)80年代以來，隨著海洋經(jīng)濟快速發(fā)展，我國刺參增養(yǎng)殖隨之迅猛發(fā)展，已經(jīng)形成了產(chǎn)業(yè)化。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國刺參產(chǎn)量產(chǎn)值每三至五年翻一番。目前，刺參的年產(chǎn)量已接近20萬噸，產(chǎn)值達(dá)到300億元以上，刺參已經(jīng)成為我國水產(chǎn)業(yè)單種產(chǎn)值最高的經(jīng)濟物種之一。

隨著刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，必須加強刺參生物學(xué)特性、遺傳多樣性、功能基因的開發(fā)與利用等等方面的研究，才能科學(xué)開展刺參新品種的培育與健康養(yǎng)殖。在科研工作中，以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、微衛(wèi)星（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNPs）等遺傳信息的分析在水產(chǎn)動物遺傳育種、遺傳多樣性研究等方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。為獲得高質(zhì)量的刺參基因組DNA，馮志綱等（2008）和孫孝德等（2010）進(jìn)行了刺參基因組DNA提取方法的探討，但他們都是采用活體刺參即時采樣，即時提取[2-3]。而在實際科研工作中，科研工作者往往需要到刺參養(yǎng)殖場進(jìn)行采樣，通過將刺參樣品保存在70%的乙醇固定液中帶回實驗室。常規(guī)的酚-氯仿抽提法雖然適用于各種動物組織DNA的提取，簡單易行，一般實驗室即可操作，但由于刺參含有豐富的黏多糖和蛋白質(zhì)[4]，所以該方法應(yīng)用于刺參DNA提取時效果并不理想。本研究優(yōu)化與改進(jìn)了酚-氯仿抽提法對適應(yīng)70%乙醇固定保存的刺參組織樣品中基因組DNA的提取，為獲得高質(zhì)量刺參基因組DNA提供方法保障。

1 材料及方法

1.1 樣品采集

實驗所用刺參取自大連某養(yǎng)殖場，用70%乙醇[5]固定刺參體壁后帶回實驗室于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取刺參基因組DNA

常規(guī)酚-氯仿抽提法見參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.1 樣品處理 取保存在70%乙醇中的刺參體壁樣品約0.2～0.4 g，用濾紙將酒精盡可能地吸干，放入滅菌的1.5 mL離心管，用剪刀剪碎。

1.2.2 水浴 向1.5 mL離心管中加入600 μL DNA提取液（10 mmol/L Tris-Cl，0.1 mol/L EDTA，0.5% SDS）和蛋白酶K（20 mg/mL）至終濃度100 μg/mL后充分混勻，放入恒溫55 ℃水浴鍋中消化，水浴時每隔15 min翻轉(zhuǎn)一次，直到消化完全。

1.2.3 萃取 將溶液冷卻至室溫，①加入等體積的用0.1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）平衡過的苯酚。將離心管置于旋轉(zhuǎn)器上，使離心管緩慢顛轉(zhuǎn)10 min以溫和地混合兩相。12 000 r/min，離心15 min，分離兩相。②取上清，加入苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混合液輕柔混勻10 min，以12 000 r/min，離心10 min。③取上清，加入等體積氯仿輕柔混勻10 min，以12 000 r/min，離心10 min。

1.2.4 沉淀DNA 在取出的上清液中加入2倍體積的-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后放在-20℃冰箱中2 h，然后以12 000 r/min，離心15 min，棄上清。

1.2.5 洗鹽 加入70%乙醇500 μL洗滌，12 000 r/min，離心5 min，棄上清后重新6 000 r/min離心5 min。取出離心管倒置在濾紙上數(shù)分鐘，吸干剩余液體。

1.2.6 溶解DNA 加入200 μL 1×TE以及2 μL RNA酶輕彈混勻后，放置于4 ℃過夜備用。

1.2.7 檢測 制備1%的瓊脂糖凝膠，用EB顯色，3 μL的DNA模板與3 μL的6×Loading buffer混勻上樣，120 V電泳20 min，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像顯示DNA的質(zhì)量，用微量核酸蛋白檢測儀（NV3000）測定DNA的純度與濃度。

1.3 改進(jìn)的刺參基因組DNA提取方法

將1.2.2中裂解液EDTA的濃度提高了10倍，為1 mol/L。

將1.2.3中①加入等體積Tris-平衡酚調(diào)整為酚/仿6：1（v/v）。將1.2.3中②、③步中苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿混勻時間縮短為5 min。將12.3萃取后增加3次氯仿抽提次數(shù)。

1.4 DNA提取試劑盒

應(yīng)用天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒，按照說明書的方法對70%乙醇保存的刺參樣品進(jìn)行基因組DNA提取。

1.5 PCR擴增

1.5.1 微衛(wèi)星位點選擇 選取刺參微衛(wèi)星序列（GenBank No.EF032102），設(shè)計引物，擴增的目的片段大小為237bp。 上游引物序列：5′–TCCGACTTTTAGGACCAGAT–3′；下游引物序列：5′–TGGGTTTTCACCTCAGACG–3′。

1.5.2 PCR反應(yīng)體系 25 μL體系，包括10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP 2μL；上、下游引物（10 M）各2 μL，DNA模板1 μL，TaqE（5 U/μL）0.5 μL；ddH2O 15 μL。

1.5.3 PCR擴增程序 94 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)行如下26個循環(huán)：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸7 min。

2 結(jié)果與討論

本研究采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法、改進(jìn)方法和公司試劑盒的三種方法對70%乙醇保存的刺參體壁組織樣品進(jìn)行基因組DNA的提取，DNA提取結(jié)果見圖1。由圖1可見，常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒提取的DNA，從瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出提取的基因組DNA有降解、凝膠孔中存在大分子雜質(zhì)。而改進(jìn)的酚-氯仿法提取的DNA，從瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出提取的基因組DNA條帶清晰、整齊，說明提取的基因組DNA分子較完整、無雜質(zhì)、基本沒有降解。經(jīng)微量核酸蛋白檢測儀測得常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒提取的基因組DNA在260 nm和280 nm的光密度值的比值（A260/A280）分別為1.26和149，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1.8，說明DNA中有蛋白等雜質(zhì)的存在；而改進(jìn)的酚-氯仿法法提取的基因組DNA的A260/A280為1.89，在理想值范圍。常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取的DNA濃度為404 μg/mL，試劑盒法提取的DNA濃度為319 μg/mL，改進(jìn)的酚-氯仿法法提取的基因組DNA的濃度為389 μg/mL。

（a常規(guī)的酚-氯仿方法、b為試劑盒方法、c改進(jìn)的酚-氯仿方法）

分子標(biāo)記技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)之上的，而模版DNA的質(zhì)量又是影響PCR擴增的關(guān)鍵因素。因此如何得到更高質(zhì)量的刺參基因組DNA至關(guān)重要。盡管有以活體取管足等組織提取刺參基因組DNA，但對于保存在70%乙醇中的刺參樣品提取高質(zhì)量DNA的報道文獻(xiàn)不多。經(jīng)過多次反復(fù)應(yīng)用常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒進(jìn)行刺參基因組DNA的提取，提取的效果很不理想，這主要是由于刺參體內(nèi)黏多糖和蛋白質(zhì)含量相當(dāng)豐富。本文針對刺參的生物學(xué)特點，在對刺參組織樣品進(jìn)行消化時，將裂解液中EDTA的濃度提高了10倍。因為EDTA具有拆解蛋白質(zhì)的能力，這就分擔(dān)了后面酚仿萃取時的壓力。同時，針對刺參DNA提取過程中極易降解的特點，我們改變了酚仿抽提時間和次數(shù)。本實驗的結(jié)果表明：以改進(jìn)的酚-氯仿法提取的刺參基因組DNA，其A260/A280比值理想；從SSR-PCR擴增結(jié)果來看，以改進(jìn)的酚-氯仿法提取的刺參基因組DNA為模版擴增的PCR產(chǎn)物效果更好。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王穎，仇雪梅，王娟，王秀利.刺參病害現(xiàn)狀及其生物技術(shù)檢測的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，2009 （11）： 60-64

[2] 馮志綱，于佳平，丁君，等.仿刺參基因組 DNA 提取方法改進(jìn)[J].生物技術(shù)通報 （S1）： 2008年增刊：352-355

[3] 孫孝德，孫國華，楊建敏，等.刺參基因組 DNA 提取的探討[J].生物技術(shù)通報，2010（3）：149-153

[4] 蘇秀榕，婁永江，常亞青，等.海參的營養(yǎng)成分及海參多糖的抗腫瘤活性的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2003，25（2）： 181-182

[5] 劉保忠， 宋林生，相建海.海灣扇貝樣品不同保存條件下 DNA 的提取及 RAPD 擴增比較[J].海洋科學(xué)，2001， 25（3）： 51-53

[6] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T. Molecular cloning [M]. New York： Cold spring harbor laboratory press， 1989

刺參（Apostichopus japonicus）分類學(xué)上隸屬于棘皮動物門、游走亞門、海參綱、楯手目、刺參科，是重要的經(jīng)濟海參物種[1]。刺參含有豐富的蛋白質(zhì)、酸性黏多糖、維生素、氨基酸、海參皂苷以及多種微量元素和生理活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)、保健和藥用價值。其中以產(chǎn)于我國遼寧、山東沿海的刺參營養(yǎng)、藥用價值最高。隨著人們生活水平的提高，刺參市場需求量顯著增加。20世紀(jì)80年代以來，隨著海洋經(jīng)濟快速發(fā)展，我國刺參增養(yǎng)殖隨之迅猛發(fā)展，已經(jīng)形成了產(chǎn)業(yè)化。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國刺參產(chǎn)量產(chǎn)值每三至五年翻一番。目前，刺參的年產(chǎn)量已接近20萬噸，產(chǎn)值達(dá)到300億元以上，刺參已經(jīng)成為我國水產(chǎn)業(yè)單種產(chǎn)值最高的經(jīng)濟物種之一。

隨著刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，必須加強刺參生物學(xué)特性、遺傳多樣性、功能基因的開發(fā)與利用等等方面的研究，才能科學(xué)開展刺參新品種的培育與健康養(yǎng)殖。在科研工作中，以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、微衛(wèi)星（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNPs）等遺傳信息的分析在水產(chǎn)動物遺傳育種、遺傳多樣性研究等方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。為獲得高質(zhì)量的刺參基因組DNA，馮志綱等（2008）和孫孝德等（2010）進(jìn)行了刺參基因組DNA提取方法的探討，但他們都是采用活體刺參即時采樣，即時提取[2-3]。而在實際科研工作中，科研工作者往往需要到刺參養(yǎng)殖場進(jìn)行采樣，通過將刺參樣品保存在70%的乙醇固定液中帶回實驗室。常規(guī)的酚-氯仿抽提法雖然適用于各種動物組織DNA的提取，簡單易行，一般實驗室即可操作，但由于刺參含有豐富的黏多糖和蛋白質(zhì)[4]，所以該方法應(yīng)用于刺參DNA提取時效果并不理想。本研究優(yōu)化與改進(jìn)了酚-氯仿抽提法對適應(yīng)70%乙醇固定保存的刺參組織樣品中基因組DNA的提取，為獲得高質(zhì)量刺參基因組DNA提供方法保障。

1 材料及方法

1.1 樣品采集

實驗所用刺參取自大連某養(yǎng)殖場，用70%乙醇[5]固定刺參體壁后帶回實驗室于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取刺參基因組DNA

常規(guī)酚-氯仿抽提法見參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.1 樣品處理 取保存在70%乙醇中的刺參體壁樣品約0.2～0.4 g，用濾紙將酒精盡可能地吸干，放入滅菌的1.5 mL離心管，用剪刀剪碎。

1.2.2 水浴 向1.5 mL離心管中加入600 μL DNA提取液（10 mmol/L Tris-Cl，0.1 mol/L EDTA，0.5% SDS）和蛋白酶K（20 mg/mL）至終濃度100 μg/mL后充分混勻，放入恒溫55 ℃水浴鍋中消化，水浴時每隔15 min翻轉(zhuǎn)一次，直到消化完全。

1.2.3 萃取 將溶液冷卻至室溫，①加入等體積的用0.1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）平衡過的苯酚。將離心管置于旋轉(zhuǎn)器上，使離心管緩慢顛轉(zhuǎn)10 min以溫和地混合兩相。12 000 r/min，離心15 min，分離兩相。②取上清，加入苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混合液輕柔混勻10 min，以12 000 r/min，離心10 min。③取上清，加入等體積氯仿輕柔混勻10 min，以12 000 r/min，離心10 min。

1.2.4 沉淀DNA 在取出的上清液中加入2倍體積的-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后放在-20℃冰箱中2 h，然后以12 000 r/min，離心15 min，棄上清。

1.2.5 洗鹽 加入70%乙醇500 μL洗滌，12 000 r/min，離心5 min，棄上清后重新6 000 r/min離心5 min。取出離心管倒置在濾紙上數(shù)分鐘，吸干剩余液體。

1.2.6 溶解DNA 加入200 μL 1×TE以及2 μL RNA酶輕彈混勻后，放置于4 ℃過夜備用。

1.2.7 檢測 制備1%的瓊脂糖凝膠，用EB顯色，3 μL的DNA模板與3 μL的6×Loading buffer混勻上樣，120 V電泳20 min，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像顯示DNA的質(zhì)量，用微量核酸蛋白檢測儀（NV3000）測定DNA的純度與濃度。

1.3 改進(jìn)的刺參基因組DNA提取方法

將1.2.2中裂解液EDTA的濃度提高了10倍，為1 mol/L。

將1.2.3中①加入等體積Tris-平衡酚調(diào)整為酚/仿6：1（v/v）。將1.2.3中②、③步中苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿混勻時間縮短為5 min。將12.3萃取后增加3次氯仿抽提次數(shù)。

1.4 DNA提取試劑盒

應(yīng)用天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒，按照說明書的方法對70%乙醇保存的刺參樣品進(jìn)行基因組DNA提取。

1.5 PCR擴增

1.5.1 微衛(wèi)星位點選擇 選取刺參微衛(wèi)星序列（GenBank No.EF032102），設(shè)計引物，擴增的目的片段大小為237bp。 上游引物序列：5′–TCCGACTTTTAGGACCAGAT–3′；下游引物序列：5′–TGGGTTTTCACCTCAGACG–3′。

1.5.2 PCR反應(yīng)體系 25 μL體系，包括10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP 2μL；上、下游引物（10 M）各2 μL，DNA模板1 μL，TaqE（5 U/μL）0.5 μL；ddH2O 15 μL。

1.5.3 PCR擴增程序 94 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)行如下26個循環(huán)：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸7 min。

2 結(jié)果與討論

本研究采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法、改進(jìn)方法和公司試劑盒的三種方法對70%乙醇保存的刺參體壁組織樣品進(jìn)行基因組DNA的提取，DNA提取結(jié)果見圖1。由圖1可見，常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒提取的DNA，從瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出提取的基因組DNA有降解、凝膠孔中存在大分子雜質(zhì)。而改進(jìn)的酚-氯仿法提取的DNA，從瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出提取的基因組DNA條帶清晰、整齊，說明提取的基因組DNA分子較完整、無雜質(zhì)、基本沒有降解。經(jīng)微量核酸蛋白檢測儀測得常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒提取的基因組DNA在260 nm和280 nm的光密度值的比值（A260/A280）分別為1.26和149，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1.8，說明DNA中有蛋白等雜質(zhì)的存在；而改進(jìn)的酚-氯仿法法提取的基因組DNA的A260/A280為1.89，在理想值范圍。常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取的DNA濃度為404 μg/mL，試劑盒法提取的DNA濃度為319 μg/mL，改進(jìn)的酚-氯仿法法提取的基因組DNA的濃度為389 μg/mL。

（a常規(guī)的酚-氯仿方法、b為試劑盒方法、c改進(jìn)的酚-氯仿方法）

分子標(biāo)記技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)之上的，而模版DNA的質(zhì)量又是影響PCR擴增的關(guān)鍵因素。因此如何得到更高質(zhì)量的刺參基因組DNA至關(guān)重要。盡管有以活體取管足等組織提取刺參基因組DNA，但對于保存在70%乙醇中的刺參樣品提取高質(zhì)量DNA的報道文獻(xiàn)不多。經(jīng)過多次反復(fù)應(yīng)用常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒進(jìn)行刺參基因組DNA的提取，提取的效果很不理想，這主要是由于刺參體內(nèi)黏多糖和蛋白質(zhì)含量相當(dāng)豐富。本文針對刺參的生物學(xué)特點，在對刺參組織樣品進(jìn)行消化時，將裂解液中EDTA的濃度提高了10倍。因為EDTA具有拆解蛋白質(zhì)的能力，這就分擔(dān)了后面酚仿萃取時的壓力。同時，針對刺參DNA提取過程中極易降解的特點，我們改變了酚仿抽提時間和次數(shù)。本實驗的結(jié)果表明：以改進(jìn)的酚-氯仿法提取的刺參基因組DNA，其A260/A280比值理想；從SSR-PCR擴增結(jié)果來看，以改進(jìn)的酚-氯仿法提取的刺參基因組DNA為模版擴增的PCR產(chǎn)物效果更好。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王穎，仇雪梅，王娟，王秀利.刺參病害現(xiàn)狀及其生物技術(shù)檢測的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，2009 （11）： 60-64

[2] 馮志綱，于佳平，丁君，等.仿刺參基因組 DNA 提取方法改進(jìn)[J].生物技術(shù)通報 （S1）： 2008年增刊：352-355

[3] 孫孝德，孫國華，楊建敏，等.刺參基因組 DNA 提取的探討[J].生物技術(shù)通報，2010（3）：149-153

[4] 蘇秀榕，婁永江，常亞青，等.海參的營養(yǎng)成分及海參多糖的抗腫瘤活性的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2003，25（2）： 181-182

[5] 劉保忠， 宋林生，相建海.海灣扇貝樣品不同保存條件下 DNA 的提取及 RAPD 擴增比較[J].海洋科學(xué)，2001， 25（3）： 51-53

[6] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T. Molecular cloning [M]. New York： Cold spring harbor laboratory press， 1989

刺參（Apostichopus japonicus）分類學(xué)上隸屬于棘皮動物門、游走亞門、海參綱、楯手目、刺參科，是重要的經(jīng)濟海參物種[1]。刺參含有豐富的蛋白質(zhì)、酸性黏多糖、維生素、氨基酸、海參皂苷以及多種微量元素和生理活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)、保健和藥用價值。其中以產(chǎn)于我國遼寧、山東沿海的刺參營養(yǎng)、藥用價值最高。隨著人們生活水平的提高，刺參市場需求量顯著增加。20世紀(jì)80年代以來，隨著海洋經(jīng)濟快速發(fā)展，我國刺參增養(yǎng)殖隨之迅猛發(fā)展，已經(jīng)形成了產(chǎn)業(yè)化。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國刺參產(chǎn)量產(chǎn)值每三至五年翻一番。目前，刺參的年產(chǎn)量已接近20萬噸，產(chǎn)值達(dá)到300億元以上，刺參已經(jīng)成為我國水產(chǎn)業(yè)單種產(chǎn)值最高的經(jīng)濟物種之一。

隨著刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，必須加強刺參生物學(xué)特性、遺傳多樣性、功能基因的開發(fā)與利用等等方面的研究，才能科學(xué)開展刺參新品種的培育與健康養(yǎng)殖。在科研工作中，以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、微衛(wèi)星（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNPs）等遺傳信息的分析在水產(chǎn)動物遺傳育種、遺傳多樣性研究等方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。為獲得高質(zhì)量的刺參基因組DNA，馮志綱等（2008）和孫孝德等（2010）進(jìn)行了刺參基因組DNA提取方法的探討，但他們都是采用活體刺參即時采樣，即時提取[2-3]。而在實際科研工作中，科研工作者往往需要到刺參養(yǎng)殖場進(jìn)行采樣，通過將刺參樣品保存在70%的乙醇固定液中帶回實驗室。常規(guī)的酚-氯仿抽提法雖然適用于各種動物組織DNA的提取，簡單易行，一般實驗室即可操作，但由于刺參含有豐富的黏多糖和蛋白質(zhì)[4]，所以該方法應(yīng)用于刺參DNA提取時效果并不理想。本研究優(yōu)化與改進(jìn)了酚-氯仿抽提法對適應(yīng)70%乙醇固定保存的刺參組織樣品中基因組DNA的提取，為獲得高質(zhì)量刺參基因組DNA提供方法保障。

1 材料及方法

1.1 樣品采集

實驗所用刺參取自大連某養(yǎng)殖場，用70%乙醇[5]固定刺參體壁后帶回實驗室于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取刺參基因組DNA

常規(guī)酚-氯仿抽提法見參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.1 樣品處理 取保存在70%乙醇中的刺參體壁樣品約0.2～0.4 g，用濾紙將酒精盡可能地吸干，放入滅菌的1.5 mL離心管，用剪刀剪碎。

1.2.2 水浴 向1.5 mL離心管中加入600 μL DNA提取液（10 mmol/L Tris-Cl，0.1 mol/L EDTA，0.5% SDS）和蛋白酶K（20 mg/mL）至終濃度100 μg/mL后充分混勻，放入恒溫55 ℃水浴鍋中消化，水浴時每隔15 min翻轉(zhuǎn)一次，直到消化完全。

1.2.3 萃取 將溶液冷卻至室溫，①加入等體積的用0.1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）平衡過的苯酚。將離心管置于旋轉(zhuǎn)器上，使離心管緩慢顛轉(zhuǎn)10 min以溫和地混合兩相。12 000 r/min，離心15 min，分離兩相。②取上清，加入苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混合液輕柔混勻10 min，以12 000 r/min，離心10 min。③取上清，加入等體積氯仿輕柔混勻10 min，以12 000 r/min，離心10 min。

1.2.4 沉淀DNA 在取出的上清液中加入2倍體積的-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后放在-20℃冰箱中2 h，然后以12 000 r/min，離心15 min，棄上清。

1.2.5 洗鹽 加入70%乙醇500 μL洗滌，12 000 r/min，離心5 min，棄上清后重新6 000 r/min離心5 min。取出離心管倒置在濾紙上數(shù)分鐘，吸干剩余液體。

1.2.6 溶解DNA 加入200 μL 1×TE以及2 μL RNA酶輕彈混勻后，放置于4 ℃過夜備用。

1.2.7 檢測 制備1%的瓊脂糖凝膠，用EB顯色，3 μL的DNA模板與3 μL的6×Loading buffer混勻上樣，120 V電泳20 min，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像顯示DNA的質(zhì)量，用微量核酸蛋白檢測儀（NV3000）測定DNA的純度與濃度。

1.3 改進(jìn)的刺參基因組DNA提取方法

將1.2.2中裂解液EDTA的濃度提高了10倍，為1 mol/L。

將1.2.3中①加入等體積Tris-平衡酚調(diào)整為酚/仿6：1（v/v）。將1.2.3中②、③步中苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿混勻時間縮短為5 min。將12.3萃取后增加3次氯仿抽提次數(shù)。

1.4 DNA提取試劑盒

應(yīng)用天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒，按照說明書的方法對70%乙醇保存的刺參樣品進(jìn)行基因組DNA提取。

1.5 PCR擴增

1.5.1 微衛(wèi)星位點選擇 選取刺參微衛(wèi)星序列（GenBank No.EF032102），設(shè)計引物，擴增的目的片段大小為237bp。 上游引物序列：5′–TCCGACTTTTAGGACCAGAT–3′；下游引物序列：5′–TGGGTTTTCACCTCAGACG–3′。

1.5.2 PCR反應(yīng)體系 25 μL體系，包括10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP 2μL；上、下游引物（10 M）各2 μL，DNA模板1 μL，TaqE（5 U/μL）0.5 μL；ddH2O 15 μL。

1.5.3 PCR擴增程序 94 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)行如下26個循環(huán)：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸7 min。

2 結(jié)果與討論

本研究采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法、改進(jìn)方法和公司試劑盒的三種方法對70%乙醇保存的刺參體壁組織樣品進(jìn)行基因組DNA的提取，DNA提取結(jié)果見圖1。由圖1可見，常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒提取的DNA，從瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出提取的基因組DNA有降解、凝膠孔中存在大分子雜質(zhì)。而改進(jìn)的酚-氯仿法提取的DNA，從瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出提取的基因組DNA條帶清晰、整齊，說明提取的基因組DNA分子較完整、無雜質(zhì)、基本沒有降解。經(jīng)微量核酸蛋白檢測儀測得常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒提取的基因組DNA在260 nm和280 nm的光密度值的比值（A260/A280）分別為1.26和149，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1.8，說明DNA中有蛋白等雜質(zhì)的存在；而改進(jìn)的酚-氯仿法法提取的基因組DNA的A260/A280為1.89，在理想值范圍。常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取的DNA濃度為404 μg/mL，試劑盒法提取的DNA濃度為319 μg/mL，改進(jìn)的酚-氯仿法法提取的基因組DNA的濃度為389 μg/mL。

（a常規(guī)的酚-氯仿方法、b為試劑盒方法、c改進(jìn)的酚-氯仿方法）

分子標(biāo)記技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)之上的，而模版DNA的質(zhì)量又是影響PCR擴增的關(guān)鍵因素。因此如何得到更高質(zhì)量的刺參基因組DNA至關(guān)重要。盡管有以活體取管足等組織提取刺參基因組DNA，但對于保存在70%乙醇中的刺參樣品提取高質(zhì)量DNA的報道文獻(xiàn)不多。經(jīng)過多次反復(fù)應(yīng)用常規(guī)的酚-氯仿法和試劑盒進(jìn)行刺參基因組DNA的提取，提取的效果很不理想，這主要是由于刺參體內(nèi)黏多糖和蛋白質(zhì)含量相當(dāng)豐富。本文針對刺參的生物學(xué)特點，在對刺參組織樣品進(jìn)行消化時，將裂解液中EDTA的濃度提高了10倍。因為EDTA具有拆解蛋白質(zhì)的能力，這就分擔(dān)了后面酚仿萃取時的壓力。同時，針對刺參DNA提取過程中極易降解的特點，我們改變了酚仿抽提時間和次數(shù)。本實驗的結(jié)果表明：以改進(jìn)的酚-氯仿法提取的刺參基因組DNA，其A260/A280比值理想；從SSR-PCR擴增結(jié)果來看，以改進(jìn)的酚-氯仿法提取的刺參基因組DNA為模版擴增的PCR產(chǎn)物效果更好。

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