堿蓬金屬硫蛋白基因?qū)μ妓猁}脅迫的應(yīng)答

金淑梅，孫 丹，王 吉

(東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

堿蓬金屬硫蛋白基因?qū)μ妓猁}脅迫的應(yīng)答

金淑梅，孫 丹，王 吉

(東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

從堿蓬(Suaedaglauca)中分離了一個Ⅱ型金屬硫蛋白基因(SgMT)，該基因讀碼框?yàn)?34 bp，編碼78個氨基酸。利用qRT-PCR發(fā)現(xiàn)SgMT基因在種子和葉中高度表達(dá)。在不同濃度的Na2CO3和NaHCO3鹽脅迫條件下，堿蓬種子中SgMT基因的表達(dá)量也在逐漸增大。不同pH值對SgMT基因的表達(dá)量無顯著影響。將SgMT導(dǎo)入酵母細(xì)胞，在添加12 mmol·L-1Na2CO3和26 mmol·L-1NaHCO3的酵母培養(yǎng)基中，含有轉(zhuǎn)SgMT基因的酵母生長明顯好于對照酵母的生長。在不同pH值的酵母培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)SgMT基因和未轉(zhuǎn)基因酵母的生長沒有明顯的區(qū)別。這些結(jié)果說明在碳酸鹽脅迫過程中，金屬硫蛋白基因在植物提高環(huán)境逆境脅迫過程中起著一定的作用。

堿蓬；金屬硫蛋白；鹽脅迫；pH值

堿蓬(Suaedaglauca)為堿蓬屬一年生草本，作為改良鹽堿地的“先鋒植物”[1]，具有很強(qiáng)的耐鹽堿能力，分布在松嫩平原上的堿蓬能在碳酸鹽含量較高的堿斑上正常生長，在重度鹽堿地區(qū)上形成的大面積堿蓬群落是土壤嚴(yán)重堿化的標(biāo)志[2]。

以NaCl和Na2SO4為主的鹽化土壤和以Na2CO3、NaHCO3為主的堿化土壤總稱為鹽堿土壤[3]。黑龍江省松嫩平原的草地上存在不同程度以Na2CO3和NaHCO3為主的堿性鹽堿土[4]。鹽堿對植物種子萌發(fā)具有毒害作用，白三葉(Trifoliumrepens)種子對NaCl、Na2CO3的耐受濃度閾值分別為300和100 mmol·L-1[5]。堿茅(Puccinelliadistans)種子在340 mmol·L-1NaCl脅迫下不能發(fā)芽[6]。關(guān)于堿蓬屬種子萌發(fā)也有相關(guān)報道，翅堿蓬(S.pterantha)種子能耐受NaCl脅迫，但當(dāng)NaCl溶液的濃度達(dá)到600 mmol·L-1時，種子幾乎不發(fā)芽[7]。在800 mmol·L-1的NaCl溶液中，囊果堿蓬(S.physophora)只有極少數(shù)種子萌發(fā)[8]，目前，有關(guān)鹽堿脅迫對堿蓬影響的報道較少，當(dāng)用100 mmol·L-1Na2CO3或300 mmol·L-1NaHCO3溶液處理土壤時，堿蓬種子萌發(fā)會被顯著抑制[9-10]。利用CaCl2等外源物質(zhì)浸種，能提高鹽地堿蓬種子的發(fā)芽率和發(fā)芽速度[11]。魏磊等[12]利用400 mmol·L-1NaCl或200 mmol·L-1NaHCO3處理堿蓬幼苗，處理組的凈光合速率值與未加鹽處理相比分別減少了73.7%和76.0%。

金屬硫蛋白(Metallothioneins，MTs)最初是從馬的腎臟中提取出來的一類富含半胱氨酸[13]、能結(jié)合重金屬離子的低分子量蛋白質(zhì)[14]。東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建實(shí)驗(yàn)室從堿蓬植株中克隆出一個金屬硫蛋白基因，發(fā)現(xiàn)該基因與鹽堿逆境有一定關(guān)系，為了檢測堿蓬金屬硫蛋白基因在種子萌發(fā)時與鹽堿脅迫的應(yīng)答關(guān)系，選取了Na2CO3和NaHCO3碳酸鹽逆境、不同酸堿度對SgMT基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)特性進(jìn)行了研究，并利用酵母細(xì)胞，進(jìn)一步研究了SgMT基因與鹽堿的關(guān)系。有關(guān)鹽堿和酸堿度脅迫對堿蓬種子萌發(fā)時金屬硫蛋白表達(dá)的研究還未見報道。在分子水平上，植物抵御鹽堿脅迫有多種可能的機(jī)制[15]，堿蓬是高度耐鹽堿植物，其金屬硫蛋白基因在堿蓬抗逆性中是否發(fā)揮作用呢？目前對金屬硫蛋白基因研究主要集中在與金屬的關(guān)系上[16]，缺少對金屬硫蛋白基因在NaHCO3和Na2CO3等堿性鹽脅迫下表達(dá)的研究，而黑龍江省多數(shù)為含有一定堿性鹽的蘇打鹽堿土，因此，研究金屬硫蛋白基因在堿性鹽脅迫的表達(dá)更有意義。鑒于此，本研究主要對在不同鹽逆境脅迫下的金屬硫蛋白基因的表達(dá)特性進(jìn)行研究，以期為闡明SgMT基因提高植物鹽堿抗性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

堿蓬植株和種子采自黑龍江省安達(dá)市重度鹽堿化地區(qū)。

1.2方法

1.2.1基因的RT-PCR克隆 根據(jù)GenBank上EST片段(登錄號：HS411207)查詢核苷酸序列，通過同源性比對，與海蓬子(Salicorniaeuropaea)的Ⅱ型金屬硫蛋白序列(JF780913)的近3’端片斷存在83%的相似性，根據(jù)海蓬子金屬硫蛋白基因的核苷酸序列，設(shè)計RT-PCR引物，SgMTF：5′-ATGTCTTGCTGTGGTGGT-3′和SgMTR：5′-TCATTTGCAGTGCAAGGG-3′。采用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取新鮮堿蓬植株總RNA；按照M-MLV cDNA合成試劑盒(寶生物)的操作說明，把總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以其為擴(kuò)增模板，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物片段回收、連接T載體后測序。

1.2.2SgMT基因在堿蓬各個器官中的表達(dá)情況 采集新鮮堿蓬根、莖、葉、花、種子，用Trizol法提取各器官的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)堿蓬金屬硫蛋白基因和堿蓬肌動蛋白Actin(EU429457)序列[17]設(shè)計引物。序列如下：

SgMTF：5′-ATGTCTTGCTGTGGTGGT-3′

SgMTR：5′-TCATTTGCAGTGCAAGGG-3′

ActinF：5′-GTGGTCGTACAACAGTA-3′

ActinR：5′-GACCCTCCAATCCAGACA-3′

利用SYBR Green Ⅰ試劑盒(Tiangen)進(jìn)行實(shí)時熒光定量qRT-PCR檢測，每個樣品都做3個平行試驗(yàn)。經(jīng)優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為20.0 μL(2×Sybr Green mix 10.0 μL；10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL；cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8.0 μL)；反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)2-△△Ct的方法計算SgMT基因的表達(dá)水平。得到的各器官中堿蓬金屬硫蛋白表達(dá)量，利用SPSS軟件中的方差分析進(jìn)行各組間的比較。

1.2.3SgMT基因在逆境處理后的堿蓬種子中的表達(dá) 每個處理分別選取30 粒種子，3次重復(fù)，在Na2CO3(50、100、150、200 mmol·L-1)、NaHCO3(100、200、300、400 mmol·L-1)、酸堿度(pH值6、7、8、9、10)逆境處理3 d后，提取種子RNA。種子總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qRT-PCR分析SgMT基因在逆境處理后的堿蓬種子中的表達(dá)情況，最后得到的相對表達(dá)量利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

1.2.4SgMT基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá) 酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建:為構(gòu)建SgMT基因的酵母表達(dá)載體，選用了在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中能誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白的pYES2載體，該載體中的半乳糖激酶啟動子(GAL1)能夠在釀酒酵母中被半乳糖高水平地誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，同時能夠被葡萄糖抑制表達(dá)。首先設(shè)計在基因讀碼框上游添加BamHⅠ和下游添加XhoⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物，PCR獲得增設(shè)酶切位點(diǎn)的SgMT基因讀碼框片段，用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pMD18-T-(BamHⅠ)SgMT(XhoⅠ)連接T載體的質(zhì)粒，同時用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pYES2質(zhì)粒DNA，相應(yīng)地回收SgMT基因目的片段和pYES2載體，經(jīng)T4連接酶連接兩者，測序正確后命名為pYES2-SgMT。pYES2(對照)和pYES2-SgMT(過量表達(dá)SgMT基因)兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞INScⅠ中，用于抗性分析。

在酵母中的抗性分析:挑取含有pYES2和pYES2-SgMT的酵母單克隆于YPD(Yeast Extract 10 g·L-1、Peptone 20 g·L-1、Glucose 20 g·L-1)液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜。次日用分光光度計分別測菌液的OD600值，調(diào)整菌液OD600值為0.8，取樣至離心管，離心棄上清后，加入滅菌水500 μL。將菌液用H2O分別稀釋至10-1，10-2，10-3，10-4，10-55個濃度。每個濃度吸取5 μL菌液分別點(diǎn)在未處理的，和含12 mmol·L-1Na2CO3、26 mmol·L-1NaHCO3(通過梯度試驗(yàn)后選取的最佳濃度)及不同酸堿度(pH值6、7、8、9、10)的YPG(Yeast Extract 10 g·L-1、Peptone 20 g·L-1、Galactose 20 g·L-1)固體培養(yǎng)基上，觀察兩種酵母的生長情況。30 ℃培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行觀測照相。

2 結(jié)果與分析

2.1SgMT基因的克隆

將提取堿蓬植株的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，利用特異設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，電泳后在200 bp左右有明顯的條帶，回收PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，命名為pMD18-T-SgMT，SgMT基因編碼區(qū)測序?yàn)?34 bp，利用Primer premier 5軟件，發(fā)現(xiàn)編碼78個氨基酸。通過NCBI氨基酸序列同源性比對，結(jié)果顯示堿蓬金屬硫蛋白(SgMT)與海蓬子Ⅱ型金屬硫蛋白(SbMT ofSalicorniabrachiata)(JF780913)有很高的相似度，其同源性達(dá)到了83%(圖1)。在數(shù)據(jù)庫中得到的其他相關(guān)蛋白是巴拉圭茶(IpMT ofIlexparaguariensis)(AFP93964.1)和花生的Ⅱ型金屬硫蛋白(AhMT ofArachishypogaea)(ABA08415.1)，與他們的氨基酸序列都有80%的同源性。同時得到堿蓬金屬硫蛋白的氨基酸序列與二色補(bǔ)血草Ⅱ型金屬硫蛋白(LbMT ofLimoniumbicolor)(ABL10085.1)和蠅子草Ⅱ型金屬硫蛋白(SnMT ofSileneniceensis)(ADP92404.1)分別達(dá)到了78%和75%(圖1)。

圖1 堿蓬金屬硫蛋白的同源性比對Fig.1 Homology alignment analysis of SgMT

2.2SgMT基因在堿蓬各個器官中的表達(dá)特性

SgMT基因在堿蓬不同器官中的表達(dá)情況為，在種子中表達(dá)量最高，其次是葉、莖、花、根，且種子和葉與其他器官間表達(dá)量差異顯著(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同堿蓬器官中金屬硫蛋白表達(dá)的定量比較Fig.2 Quantitative comparison of MT gene expression in Suaeda glauca organs by qRT-PCR

2.3不同鹽脅迫和pH值下SgMT基因表達(dá)特性

堿蓬種子金屬硫蛋白基因SgMT在Na2CO3、NaHCO3和不同pH逆境中均受到了不同程度的誘導(dǎo)，在未處理?xiàng)l件下，SgMT基因的表達(dá)量最低，基因表達(dá)量隨著各種逆境濃度的增大而增大。金屬硫蛋白的表達(dá)量在堿性鹽各個處理濃度下比未處理的條件下都明顯增加(圖3A，3B)。不同pH值處理和未處理的條件下基因的表達(dá)增加不顯著(P>0.05)(圖3C)。

2.4SgMT基因在酵母中表達(dá)及抗逆性

為了解析SgMT基因在酵母中是否具有抗逆性，以轉(zhuǎn)pYES2的酵母菌株為對照，對轉(zhuǎn)pYES2-SgMT的酵母在逆境條件下的生長進(jìn)行觀察(圖4)，在不做處理的培養(yǎng)基上(CK)，轉(zhuǎn)pYES2-SgMT與轉(zhuǎn)pYES2的酵母的生長相似。但在12 mmol·L-1Na2CO3和26 mmol·L-1NaHCO3鹽脅迫下，轉(zhuǎn)pYES2-SgMT的酵母菌株生長明顯好于轉(zhuǎn)pYES2的酵母菌株。說明攜帶SgMT基因的酵母菌株在鹽脅迫下表達(dá)提高，增強(qiáng)INVSc1菌株(pYES2-SgMT)耐鹽能力。在不同pH逆境脅迫下，轉(zhuǎn)pYES2-SgMT與轉(zhuǎn)pYES2的酵母菌株的生長沒有明顯的區(qū)別。

圖3 不同Na2CO3, NaHCO3, pH值濃度下堿蓬種子中金屬硫蛋白表達(dá)的定量比較Fig.3 Quantitative comparison of MT gene expression in Suaeda glauca seed under Na2CO3, NaHCO3, and pH value stress by qRT-PCR

圖4 過量表達(dá)pYES2-SgMT基因酵母抗逆性分析Fig.4 Resistance analysis of yeast overexpressed pYES2-SgMT recombinant plasmid

3 討論

3.1SgMT基因的克隆

Ⅱ型金屬硫蛋白，半胱氨酸排列一般為Cys-Cys，而且Cys-Cys位于氨基酸序列的第3、4位，堿蓬中克隆得到的金屬硫蛋白蛋白序列為MSCCGGNCGCGAGCKCGNGCGGCKMFPDFSESTSASTELISGVAPQRSYMGGSEMGVAAENDGCKCGDNCQCNPCTCK，第3、4位就是兩個半胱氨酸，并且通過同源序列比對，與其他植物的Ⅱ型金屬硫蛋白同源性比較大，因此斷定試驗(yàn)中克隆的基因?yàn)閴A蓬Ⅱ型金屬硫蛋白基因。

3.2SgMT基因表達(dá)的組織特異性

運(yùn)用靈敏度很高的qRT-PCR檢測不同處理的SgMT基因表達(dá)情況，每個處理中3次重復(fù)的檢測結(jié)果都很接近，說明用qRT-PCR檢測該基因表達(dá)差異的可信度是很高的。本研究中的基因在葉中的表達(dá)量明顯高于根部表達(dá)量，這與相關(guān)研究中Ⅱ型金屬硫蛋白基因主要在植物葉片中的表達(dá)量較高，在根部表達(dá)量較少的結(jié)論相符[18-19]。鹽堿是影響種子萌發(fā)的顯著因素，鹽堿環(huán)境下的種子萌發(fā)又是鹽生植物生長的關(guān)鍵和敏感階段[20]，SgMT基因在種子中的表達(dá)量最大，有可能幫助植物緩解在種子萌發(fā)期受到的鹽堿脅迫傷害，提高植物在逆境下的發(fā)芽率。

3.3鹽脅迫對堿蓬種子中SgMT基因表達(dá)特性的影響

研究結(jié)果表明，SgMT基因在轉(zhuǎn)錄水平上分別不同程度地受到了堿性鹽NaHCO3、Na2CO3逆境的誘導(dǎo)。高pH值對堿蓬種子中基因的表達(dá)沒有顯著影響。由此推測SgMT基因?qū)A性鹽脅迫有一定的應(yīng)激反應(yīng)，這種反應(yīng)不是由高pH值所引起的。

3.4過量表達(dá)堿蓬SgMT基因的酵母在鹽脅迫下的表達(dá)特性

酵母和植物都屬于真核生物，代謝途徑比較相似，對翻譯的外源蛋白質(zhì)能夠進(jìn)行折疊加工和修飾。酵母比植物生長周期短，因此試驗(yàn)周期快，本研究通過過量表達(dá)堿蓬SgMT基因的酵母細(xì)胞在堿性鹽和不用酸堿度脅迫條件下的生長狀況，來驗(yàn)證基因的功能。轉(zhuǎn)SgMT基因酵母在添加12 mmol·L-1Na2CO3和26 mmol·L-1NaHCO3的酵母培養(yǎng)基上的生長明顯好于未轉(zhuǎn)SgMT基因酵母，表明SgMT基因在酵母體內(nèi)表達(dá)后，減緩了逆境對組織和細(xì)胞傷害作用，從而提高了酵母在逆境條件下的生長。在不同pH值的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)SgMT基因酵母與未轉(zhuǎn)SgMT基因的酵母生長狀態(tài)沒有明顯的區(qū)別，這說明SgMT基因不能通過強(qiáng)化細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)控能力來提高抗鹽堿能力。SgMT基因具有良好的抗鹽堿能力是否由于SgMT基因的表達(dá)量增加，產(chǎn)生不同的金屬硫蛋白基因調(diào)控鏈，帶動其他逆境脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)SgMT基因酵母的抗逆性，尚待更深入的研究。

本研究對堿性鹽逆境下堿蓬種子中金屬硫蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，并利用酵母表達(dá)體系進(jìn)一步觀察堿蓬金屬硫蛋白基因的表達(dá)，初步揭示堿蓬高抗鹽堿性的分子機(jī)制，對充分利用堿蓬的抗逆基因資源和植物分子育種提供更多幫助。

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(責(zé)任編輯 張瑾)

2014年10月國內(nèi)市場主要畜產(chǎn)品與飼料價格分析

10月國內(nèi)主要畜產(chǎn)品和飼料價格波動中呈現(xiàn)下降態(tài)勢。

一、豬肉、雞肉和雞蛋價格下降，牛肉和羊肉價格穩(wěn)中有升

10月國內(nèi)豬肉、雞肉和雞蛋平均價格分別為19.40、15.05和10.86元·kg-1，環(huán)比分別下降2.8%、5.2%和1.6%。從區(qū)域分析，豬肉價格東部分別高于中、西部0.1%和0.1%；雞肉價格東部分別高于西、中部2.4%和7.7%；雞蛋價格西部分別高于中、東部2.6%和3.8%。牛肉平均價格54.47元·kg-1，未有明顯波動，東部分別高于中、西部0.3%和0.4%。羊肉平均價格53.29元·kg-1，環(huán)比上漲0.2%，東部分別高于中、西部2.8%和4.3%。

二、玉米、大豆、豆粕和棉粕價格不同幅度下降

10月國內(nèi)玉米、大豆、豆粕和棉粕平均價格為2 510、4 263、3 688和2 433元·t-1，環(huán)比分別下降6.2%、1.7%、0.3%和14.3%。從區(qū)域分析，玉米價格東部分別高于西、中部4.7%和4.9%；大豆價格東部分別高于西、中部1.5%和2.9%；豆粕價格西部分別高于中、東部3.3%和8.4%；棉粕價格東部分別高于中、西部0.6%和3.9%。

圖1 2014年10月國內(nèi)市場主要畜產(chǎn)品與飼料價格

數(shù)據(jù)來源：豬肉http://www.chinapig.cn/index.htm；牛肉、羊肉、雞肉、雞蛋http://www.21food.cn/；玉米、豆粕http://www.zhue.com.cn/；大豆、棉粕http://www.chinafeed.org.cn/

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 王化 整理)

Metallothioneingene(SgMT)fromSuaedaglaucaexpressionundersalinestress

JIN Shu-mei, SUN Dan, WANG Ji

(Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field (SAVER), Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

A type Ⅱ metallothionein gene (SgMT) gene was isolated fromSuaedaglaucawhich had 234 bp open reading frame and encoded 78 amino acids.SgMTwas highly expressed in seeds and leaves which were tested by qRT-PCR.SgMTgenes up-regulated under different concentrations of Na2CO3and NaHCO3salt stress and did not change under high pH conditions.The recombinant yeast cells withSgMTgrew better than control cells under 12 mmol·L-1Na2CO3and 26 mmol·L-1NaHCO3salt stress and had no difference under different pH value.These results suggested thatSgMTgene played an important role in plant adaptation to environmental stresses.

Suaedaglauca; metallothionein; saline stress; pH value

JIN Shu-mei E-mail:jinshumei1972@163.com

2014-04-09 接受日期：2014-07-15

哈爾濱市青年基金(2008RFQXN007)；國家自然科學(xué)基金 (31070616)；黑龍江省自然科學(xué)基金(C200714)；黑龍江省自然基金(留學(xué)及海外基金LC2013C10)

金淑梅(1972-),女，黑龍江明水人，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方向研究。 E-mail:jinshumei1972@163.com

Q945.78

：A

：1001-0629(2014)11-20820-06

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0161