黃花棘豆不同生長(zhǎng)時(shí)期苦馬豆素含量的分析

馬蘭波，周青平，紀(jì)亞君，顏紅波，劉文輝，丁成翔

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041)

黃花棘豆不同生長(zhǎng)時(shí)期苦馬豆素含量的分析

馬蘭波1，周青平2，紀(jì)亞君1，顏紅波1，劉文輝1，丁成翔1

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041)

采用氣相色譜法對(duì)黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)不同生育期的根、莖、葉、花、果實(shí)及地上部分全草中主要有毒成分苦馬豆素的含量進(jìn)行檢測(cè)，分析苦馬豆素的變化規(guī)律，調(diào)查并計(jì)算單位面積黃花棘豆地上全草中苦馬豆素的產(chǎn)量。結(jié)果表明，黃花棘豆果實(shí)中苦馬豆素含量最高，達(dá)到107.787 mg·kg-1；地上部分全草中苦馬豆素含量在結(jié)果期最高，達(dá)到48.19 mg·kg-1。從4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期黃花棘豆不同部位苦馬豆素含量平均值來(lái)看，果實(shí)>花>葉>莖>根；從地上部分全草中苦馬豆素含量來(lái)看，結(jié)實(shí)期>盛花期>枯萎期>孕蕾期，樣地中黃花棘豆地上部分全草苦馬豆素產(chǎn)量也符合此規(guī)律。

黃花棘豆；苦馬豆素；動(dòng)態(tài)變化

棘豆屬與黃芪屬植物因含有有毒生物堿——苦馬豆素(Swainsonine，SW)，被統(tǒng)稱為瘋草。黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)是青海省天然草地常見(jiàn)的瘋草類有毒植物之一，被各類家畜采食后會(huì)引起慢性中毒。曹光榮等[1]在黃花棘豆中提取出有毒生物堿，并認(rèn)為其主要有毒成分為苦馬豆素?？囫R豆素中毒主要是因?yàn)榭囫R豆素陽(yáng)離子與甘露糖苷酶具很高的親和性，并且酸性α-甘露糖酶的最適pH是4.0，有利于弱堿性的苦馬豆素分子離子化并快速滲入到酸性α-甘露糖苷酶作用區(qū)域與之結(jié)合，從而抑制酶功能，造成甘露糖累積，阻礙糖蛋白合成，大量低聚糖在溶酶體內(nèi)聚集，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，使家畜實(shí)質(zhì)器官細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)都受到損害[2]。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，苦馬豆素的含量直接影響著瘋草毒性的大小[3]。由于棘豆屬植物繁殖力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，而且蔓延速度較快，又含有有毒生物堿，不僅抑制其他牧草的生長(zhǎng)，而且部分種類還會(huì)因?yàn)楹锌囫R豆素而導(dǎo)致各類家畜健康狀況下降，甚至死亡；同時(shí)，苦馬豆素又具有抗癌作用。研究表明，苦馬豆素能有效逆轉(zhuǎn)致死性輻照或高劑量化療所造成的骨髓抑制，有望成為新世紀(jì)治療癌癥的克星[4]，所以近年來(lái)對(duì)瘋草的研究已成為熱點(diǎn)，人們一方面尋找有效措施對(duì)瘋草進(jìn)行脫毒處理，用于冬春季節(jié)牲畜補(bǔ)飼，提高瘋草的利用率，另一方面研究苦馬豆素提取工藝、生化特性、藥用抑瘤機(jī)理，為創(chuàng)制抗癌新藥物開(kāi)辟新天地。瘋草中苦馬豆素含量因種類、分布部位、生長(zhǎng)時(shí)期、生長(zhǎng)環(huán)境等因素而有所不同，本研究擬通過(guò)氣相色譜法，對(duì)黃花棘豆不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同組織的苦馬豆素含量進(jìn)行檢測(cè)，以研究不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同組織苦馬豆素的變化規(guī)律，為黃花棘豆合理利用及家畜中毒病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品采集

黃花棘豆孕蕾期、盛花期、結(jié)果期、枯萎期樣品，分別于2013年7、8、9、10月采集于青海省海北州剛察縣公共馬村，地理坐標(biāo)為37°19′―37°29′ N，100°28′―100°32′ E，海拔3 405～3 569 m。土壤類型為栗鈣土，草地類型為高寒草甸，樣品陰干后，粉碎備用。在每個(gè)采樣期，分別設(shè)置5塊1 m×1 m的樣方，調(diào)查黃花棘豆的高度、蓋度及地上生物量。

1.2主要試劑

甲醇(AR，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)，氯仿(AR，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)，正丁醇(AR,solarbio)，吡啶(AR，上海中秦化學(xué)試劑有限公司)，苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，美國(guó)EZNO)，雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)∶三甲基氯硅烷(TMCS)(solarbio)=99∶1(硅烷化試劑)。

1.3主要儀器

電子天平(BS 224 S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，超聲波清洗器(SB-120DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)，氣相色譜儀(Agilent Technologies 7890A，安捷倫科技有限公司)，其他常規(guī)器材。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

[5]中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法。準(zhǔn)確稱取SW標(biāo)準(zhǔn)品3.0 mg 于1 000 μL吡啶中，充分搖勻，即為SW 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密吸取200 μL SW標(biāo)準(zhǔn)品貯備液至1.5 mL 離心管里，再取5支1.5 mL 離心管分別加100 μL吡啶，按倍比稀釋的方法配置成3.00、1.50、0.750、0.375、0.188、0.094 mg·mL-16個(gè)質(zhì)量濃度梯度的溶液。分別按體積比5∶2加入硅烷化試劑，混勻后靜置20～40 min后，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。色譜條件:AT.SE-54型毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫210 ℃，進(jìn)樣口溫度300 ℃，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)溫度280 ℃，流速為2 mL·min-1，進(jìn)樣1 μL，分流比為30∶1，載氣為高純氮?dú)?，載氣壓力200 kPa。以苦馬豆素濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制苦馬豆素濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并計(jì)算線性回歸方程。

1.5黃花棘豆樣品前處理

準(zhǔn)確稱取不同生長(zhǎng)時(shí)期的根、莖、葉、花、果及地上部分樣品各10 g，加入50 mL甲醇，超聲協(xié)助提取兩次，每次30 min，收集提取液合并揮干后，總浸膏用1 mol·L-1HCl完全溶解后，氯仿萃取除雜，酸水液經(jīng)10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9～10后，再用正丁醇萃取5～8次，合并揮干，得粗生物堿部分。

1.6苦馬豆素含量測(cè)定與計(jì)算

前處理得到的正丁醇部分用吡啶超聲協(xié)助溶解，吡啶溶液按體積比5∶2加入硅烷化試劑，混勻后靜置20～40 min后進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。色譜條件同1.4。根據(jù)苦馬豆素濃度-峰面積線性回歸方程，計(jì)算出吡啶溶液中苦馬豆素的濃度，再推算出植物中苦馬豆素的含量(mg·kg-1)。

X=c×s×b×100.

式中，c表示根據(jù)線性回歸方程得出的苦馬豆素濃度(mg·mL-1)；s表示加入硅烷化試劑對(duì)吡啶溶液的稀釋倍數(shù)；b表示吡啶體積(mL)。

1.7數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0軟件分別對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期相同組織、相同生長(zhǎng)時(shí)期不同組織的苦馬豆素含量進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對(duì)各測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)對(duì)6個(gè)濃度梯度的苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行氣相測(cè)定，并對(duì)苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x)、峰面積(y)進(jìn)行線性回歸分析，得如下回歸方程：y=320.587 81x-10.793 06，R2=0.999 3，這表明，當(dāng)苦馬豆素進(jìn)樣質(zhì)量濃度處于0.094～3.0 mg·mL-1時(shí)，苦馬豆素質(zhì)量濃度與峰面積比值線性關(guān)系良好?？囫R豆素標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖如圖1所示。

圖1 苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of standard SW

2.2黃花棘豆不同生長(zhǎng)時(shí)期各組織苦馬豆素含量測(cè)定結(jié)果

所有被測(cè)樣品中，黃花棘豆果實(shí)中的苦馬豆素含量最高，達(dá)到107.787mg·kg-1(表1)。不同組織中，在孕蕾期，葉中苦馬豆素含量極顯著高于根和莖(P<0.01)；盛花期的根、莖、葉、花中苦馬豆素含量均差異極顯著，以花中苦馬豆素含量最高，達(dá)到28.438 mg·kg-1，根中最低；結(jié)實(shí)期，果實(shí)中苦馬豆素含量最高，其次是葉、莖、根，葉和莖中苦馬豆素含量未有極顯著差異(P>0.01)；枯萎期，葉中苦馬豆素含量最高，其次是果實(shí)和莖，二者間苦馬豆素含量未達(dá)到極顯著差異，根中苦馬豆素含量最低。不同生長(zhǎng)時(shí)期之間，根和莖中在苦馬豆素含量都達(dá)到極顯著差異，并且都以盛花期含量最高；葉中苦馬豆素含量在結(jié)實(shí)期最高。

地上部分全草苦馬豆素含量在結(jié)果期最高，達(dá)到48.190 mg·kg-1(圖2)，極顯著高于孕蕾期、盛花期和枯萎期(P<0.01)，孕蕾期最低，極顯著低于其他所有生長(zhǎng)期。

2.3樣方調(diào)查結(jié)果及苦馬豆素產(chǎn)量

各時(shí)期黃花棘豆平均株高、蓋度、地上生物量的調(diào)查結(jié)果(表2)表明，地上干重在結(jié)實(shí)期最高，為39.32 g·m-2，樣方內(nèi)黃花棘豆地上部分全草苦馬豆素產(chǎn)量為1.894 8 mg·m-2。樣方內(nèi)，黃花棘豆地上部分全草苦馬豆素產(chǎn)量表現(xiàn)為結(jié)實(shí)期>盛花期>枯萎期>孕蕾期。株高、地上生物量和地上部分全草苦馬豆素產(chǎn)量在盛花期、結(jié)實(shí)期和孕蕾期之間均達(dá)到極顯著差異(P<0.01)，蓋度在結(jié)實(shí)期、盛花期和孕蕾期之間有顯著差異(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

苦馬豆素屬于多羥基吲哚里西啶生物堿，在吲哚里西啶環(huán)上帶有羥基，又稱為吲哚里西啶三醇。生物堿的提取與檢測(cè)方法有很多，如曹光榮等[6]提取方法是將兩次浸泡過(guò)樣品的酸水液通過(guò)強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂，蒸餾水洗至中性，用氨水調(diào)至堿性后，依次用氯仿、丙酮洗脫，分別濃縮，得到總生物堿，再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，TLC 結(jié)合α-甘露甙酶活性抑制試驗(yàn)，分離出苦馬豆素單體；劉志濱等[7]采用超聲波協(xié)助提取，將水提液電爐加熱濃縮，離心除雜，繼續(xù)濃縮至一定體積后，調(diào)至堿性，分別用正丁醇和稀硫酸萃取，濃縮成膏狀后，再用氨性氯仿萃取，濃縮萃取液，升華后得到苦馬豆素，步驟較繁瑣。苦馬豆素的檢測(cè)方法目前有薄層掃描法、高效液相色譜分析法、酶法和氣相色譜法，各種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。本試驗(yàn)對(duì)苦馬豆素的提取及檢測(cè)采用趙興華等[8]建立的方法，簡(jiǎn)化了操作步驟，方法穩(wěn)定性好，精確度高。

表1 不同生長(zhǎng)時(shí)期各部位苦馬豆素含量Table 1 SW content in different parts at various stages mg·kg-1

注：同行不同大寫(xiě)字母表示相同部位不同生長(zhǎng)時(shí)期差異極顯著(P<0.01)，同列不同小寫(xiě)字母表示相同生長(zhǎng)時(shí)期不同部位間差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different capital letters within the same row mean significant difference among different stages in the same part at 0.01 level，and different lower case letters within the same column mean significant difference among different parts at the same stage at 0.01 level.

圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)期地上部分苦馬豆素含量的變化Fig.2 Trend chart of SW on the abovegroundat various stages

注：不同大寫(xiě)字母表示不同生長(zhǎng)時(shí)期間差異顯著(P<0.01)。

Note:Different capital letter mean significant difference among different various stages of 0.01 level.

表2 不同生育期黃花棘豆測(cè)定結(jié)果Table 2 The investigation results and SW production

注：同列不同小寫(xiě)和大寫(xiě)字母分別表示不同生長(zhǎng)時(shí)期在0.05和0.01水平上差異顯著。

Note:Different lower case and capital letters within the same column mean significant difference among different stages at 0.05 and 0.01 level，respectively.

國(guó)外研究表明棘豆中苦馬豆素含量大于0.001%水平就可造成家畜中毒[9]，國(guó)內(nèi)對(duì)苦馬豆素中毒劑量的研究表明，試驗(yàn)羊累計(jì)食入21.6～46.2 mg·kg-1苦馬豆素會(huì)出現(xiàn)中毒[10-11]。黃花棘豆果實(shí)中的苦馬豆素含量最高，達(dá)到107.787 mg·kg-1，花中苦馬豆素含量達(dá)到28.438 mg·kg-1，這些植物部位被家畜采食一定量后足以引起中毒，地上部分全草中苦馬豆素含量在結(jié)果期最高，達(dá)到48.19 mg·kg-1，相當(dāng)于結(jié)實(shí)期25.43 m2草地上全部黃花棘豆干草中苦馬豆素含量就可以引起家畜中毒，而孕蕾期和枯萎期的黃花棘豆苦馬豆素含量雖較低，但如果長(zhǎng)期采食，毒性物質(zhì)也會(huì)在體內(nèi)聚集，使動(dòng)物出現(xiàn)中毒癥狀。不同種類、不同組織、不同生長(zhǎng)時(shí)期的瘋草苦馬豆素含量都有所差別，王帥等[12]研究表明，小花棘豆(O.glabra)在結(jié)實(shí)期，果實(shí)中苦馬豆素含量最高，為58.09 mg·kg-1。劉忠艷[5]對(duì)莖直黃芪(Astragalusstrictus)、變異黃芪(A.variabilis)等9種瘋草的全草樣品苦馬豆素含量進(jìn)行比較，其中甘肅棘豆(O.kansuensis)樣品中含量最高，達(dá)到0.148‰。

苦馬豆素屬于植物次生代謝化合物，其含量受很多因素的影響，包括植物分布的海拔高度、土壤條件、天氣條件以及周圍分布的植物。Ralph等[13]對(duì)美國(guó)瘋草藍(lán)伯氏棘豆(O.lambertii)3個(gè)變種的苦馬豆素含量進(jìn)行了分析，推測(cè)該植物中苦馬豆素含量的高度變異與植物的內(nèi)生真菌有關(guān)。內(nèi)生真菌菌絲體寄生在植物體的葉、莖、花、果實(shí)、種子等地上組織的細(xì)胞和細(xì)胞間隙，并且在種子中密度最高，主要分布在糊粉層和內(nèi)皮薄壁層[14]，這就解釋了果實(shí)中苦馬豆素含量最高的原因。內(nèi)生真菌與其寄主互利共生，一方面，寄主植物為內(nèi)生真菌生長(zhǎng)繁殖提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，并通過(guò)種子幫其傳播，另一方面，內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)瘋草生長(zhǎng)發(fā)育，提高其抗逆性[15]。

黃花棘豆是青海草地上常見(jiàn)的瘋草之一，生命力強(qiáng)，生物量大，資源豐富，通過(guò)對(duì)苦馬豆素的不斷深入研究，再對(duì)其合理利用，將會(huì)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)效益。本試驗(yàn)結(jié)果表明，從4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期不同組織苦馬豆素含量平均值來(lái)看，果實(shí)>花>葉>莖>根；從地上部分全草中苦馬豆素含量來(lái)看，結(jié)果期>盛花期>枯萎期>孕蕾期，樣地中黃花棘豆地上部分全草苦馬豆素產(chǎn)量也符合此規(guī)律。

參考文獻(xiàn)

[1]曹光榮,李紹君,段得賢,劉乃利,馬雙民,黨軍海,周志明.黃花棘豆有毒成分的分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,1988,3:42-43.

[2]Dorling P R,Huxtable C R,Colegate S M.Inhibition of lysosomal α-mannosidase by swainsonine,an indolozidin alkaloid isolated fromSwainsonacanescens[J].Biochemical Journal,1980,191:649-651.

[3]劉忠艷,王占新,趙寶玉,路浩,馬堯,孫莉莎,王吉榮.我國(guó)主要瘋草苦馬豆素動(dòng)態(tài)規(guī)律研究[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京:中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì),2009:556-564.

[4]黨朝暉,張梅.苦馬豆素—抗癌新物質(zhì)[N].陜西日?qǐng)?bào),2008-03-31(第4版).

[5]劉忠艷.莖直黃芪化學(xué)成分與瘋草苦馬豆素動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2009.

[6]曹光榮,李紹君,段得賢,劉乃利,馬雙民,黨軍海,周志明,陳義忠,王定國(guó),黑正祥,史長(zhǎng)君.黃花棘豆有毒成分的分離與鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1989,17(3):1-6.

[7]劉志濱,趙興華,余永濤,王建華.甘肅棘豆中苦馬豆素提取工藝改進(jìn)初報(bào)[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,34(1):96-99.

[8]趙興華,崔忠華,耿果霞,王建華,張志敏,宋毓民,劉志濱.氣相色譜-甲基化-α-D-甘露糖苷內(nèi)標(biāo)法測(cè)定變異黃芪中的苦馬豆素[J].色譜,2007,25(5):781-782.

[9]Gardner D R,Molyneux R J,Ralphs M H.Analysis of swainsonine:Extraction methods,detection and measurement in populations of locoweeds(Oxytropisspp.)[J].Agricultural and Food Chemistry,2001,49:4573-4580.

[10]王凱,曹光榮,段得賢.黃花棘豆對(duì)山羊的毒性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),1990,21(1):80-86.

[11]顧百群,段得賢,崔中林.山羊甘肅棘豆中毒臨床病理學(xué)研究[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1990,18(3):62-68.

[12]王帥,陳根元,胡建軍,馬春暉.氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素含量[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,48(4):728-733.

[13]Ralphs M H,Creamer R,Baueom D.Relationship between the endophyteEmbellisiaspp.and the toxic alkaloid swainsonine in major locoweed species(AstragalusandOxytropis)[J].Biochemical Journal,2008,34:32-38.

[14]錢亞光,盧萍,牛艷芳,呂桂芬,陳立波,李鴻雁.含苦馬豆素棘豆屬植物及其內(nèi)生真菌的研究進(jìn)展[J].國(guó)際遺傳學(xué)雜志,2010,33(4):162-166.

[15]周啟武,白松,路浩,趙寶玉,陳基萍.瘋草內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀與存在問(wèn)題[J].草業(yè)科學(xué),2012,29(7):1049-1057.

(責(zé)任編輯 王芳)

AnalysisofswainsoninecontentsatvariousstagesinOxytropisochrocephala

MA Lan-bo1, ZHOU Qing-ping2, JI Ya-jun1, YAN Hong-bo1,LIU Wen-hui1, DING Cheng-xiang1

(1.Academy of Animal Sciences and Veterinary of Qinghai University, Xining 810016, China;2.Institute of Qinghai-Tibet Plateau at Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

The main toxic swainsonine(SW) contents ofOxytropisochrocephalain various plant parts at different stages were detected by gas chromatography (GC),the dynamic regulation of swainsonine was analyzed, the SW production of the whole grass aboveground part inO.ochrocephalaper square metre was investigated and calculated.The results showed that the SW content of fruits was the highest, which was up to 107.787 mg·kg-1, the SW content in aboveground part at fruiting stage was the highest,which was up to 48.19 mg·kg-1.The averages of SW contents in different tissues at 4 period were pods>flowers>leaves>stems>root,the SW contents in aboveground part and the SW production of the whole grass aboveground part at four growth period were different which decreased in the following order: fruiting period>florescence period>withering period>bud formation period.

Oxytropisochrocephala; swainsonine; dynamics

ZHOU Qing-ping E-mail:qpingzh@aliyun.com

2013-12-11 接受日期：2014-05-20

棘豆型毒雜草退化草地的綜合防治技術(shù)研究(美大項(xiàng)目2010)；青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用(2014-Z-Y12)；青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源研究(2014-Z-Y22)

馬蘭波(1988-)，女，甘肅徽縣人，在讀碩士生，主要從事牧草栽培育種研究。E-mail:mlbzzz@126.com

周青平(1962-)，男，甘肅寧縣人，研究員，博導(dǎo)，博士，主要從事牧草栽培與育種研究。E-mail:qpingzh@aliyun.com

S452

：A

：1001-0629(2014)11-2164-05

10.11829j.issn.1001-0629.2013-0688