兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素樣分泌細(xì)胞分化及鑒定

郭 偉,孫 昱，楊海山

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部中日聯(lián)誼醫(yī)院 放射線科,吉林 長(zhǎng)春130033)

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)最早由Zuk[1]等人于2001年從抽脂術(shù)中抽取的脂肪組織中分離培養(yǎng)，近年來已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。ADSCs是一種來源于脂肪組織中的多能干細(xì)胞，和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 類似，也有很強(qiáng)的增殖能力和分化潛能。ADSCs能在不同的誘導(dǎo)微環(huán)境下向不同的組織細(xì)胞(如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等) 分化[1]。本實(shí)驗(yàn)在體外分離培養(yǎng)兔的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，通過相應(yīng)的試劑使其誘導(dǎo)分化為類胰島素分泌細(xì)胞，并研究其生物學(xué)特性，以期為臨床采用ADSCs治療Ⅰ型糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)新西蘭大白兔3只，2.0-2.5 kg，雄性，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.2 ADSCs的分離培養(yǎng)

將新西蘭大白兔以2 ml/kg標(biāo)準(zhǔn)，用濃度為1.5%的戊巴比妥經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，無(wú)菌條件下獲取其腹股溝部位的脂肪組織，然后仔細(xì)清除脂肪外包被的筋膜及血管，用含雙抗的PBS反復(fù)沖洗多次，并將其剪碎成糊狀，再加入適量的0.15%Ⅰ型膠原酶，于37℃水浴恒溫?fù)u床消化30-50 min。然后將其用100目篩網(wǎng)過濾，濾液以1 200 r/min離心5 min，棄去上層的脂肪滴及上清，將底部的沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮，然后接種于培養(yǎng)瓶中。24小時(shí)后首次更換培養(yǎng)液，以后每三天更換一次。當(dāng)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底壁面積的70%-80%后用0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶2或1∶3比例傳代。

1.3 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

采用MTT法繪制ADSCs生長(zhǎng)曲線：分別取第3、5、10代的ADSCs，以1×104/mL的密度分別接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μl；每天同一時(shí)間，每組各取3孔細(xì)胞，每孔加入5%四唑鹽(MTT)20 μl，孵育4小時(shí)后棄去孔內(nèi)液體；用培養(yǎng)液洗兩次后分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，輕微震蕩20 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處各孔的吸光度(OD)。以3個(gè)平行樣品的平均值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間 (d) 為橫坐標(biāo)，來繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 ADSCs向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化并進(jìn)行雙硫腙染色鑒定

取第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以1×105/mL的密度接種于6孔板中，先用原有的無(wú)血清培養(yǎng)液于37℃，5%CO2條件下孵育12 h后，撤去上述培養(yǎng)液，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⑴囵B(yǎng)的細(xì)胞分為對(duì)照組和誘導(dǎo)組分別培養(yǎng)。其中對(duì)照組只用單純的高糖DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)組將分三個(gè)階段逐步進(jìn)行誘導(dǎo)分化：(1)加入含有1 mmol/L 2-巰基乙醇、2 mmol/L 谷氨酰胺的高糖DMEM，培養(yǎng)2天；(2)加入含有10 μg/L 堿性成纖維生長(zhǎng)因子、2% B27、10 μg/L 表皮生長(zhǎng)因子、2 mmol/L 谷氨酰胺的高糖DMEM，培養(yǎng)6天；(3)加入含20 mmol/L 尼克酰胺、100 nmol/L胰高血糖素樣肽-1(glucagons-like peptide-1，GLP-1)、1 mmol/L 2-巰基乙醇的高糖DMEM，培養(yǎng)6天，并于相差顯微鏡下觀察各階段細(xì)胞的形態(tài)變化。然后分別取對(duì)照組和誘導(dǎo)組14 d的細(xì)胞爬片，再用0.1 mg/ml的雙硫腙溶液(將50 mg雙硫腙加入5 ml DMSO溶解作為儲(chǔ)備液，使用時(shí)取0.1 ml加入10 ml PBS中，將其抽濾后作為染色液)進(jìn)行染色，于37℃下孵育15 min后，于倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的著色情況。

1.5 葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)

取第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以2×105/mL的密度接種于24孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)，將其分為空白對(duì)照組、低糖刺激組和高糖刺激組。對(duì)照組為未誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。低糖刺激組和高糖刺激組以上述方法進(jìn)行誘導(dǎo)，并于誘導(dǎo)后第7天、14天和21天時(shí)，每組各取8個(gè)培養(yǎng)孔，分別加入低糖DMEM(10.0 mmol/L)和高糖DMEM(30.0 mmol/L)培養(yǎng)液0.5 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集24孔板中的上清液，用Insulin-ELISA試劑盒檢測(cè)其胰島素含量。同時(shí)檢測(cè)對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)液，將其作為陰性對(duì)照。

1.6 ADSCs表面抗原標(biāo)志檢測(cè)

取第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，先用0.25%的胰蛋白酶消化10 min，PBS沖洗3遍，離心后的沉淀用500 μL Binding Buffer緩沖液懸浮，然后分別與5 μL CD29-FITC，CD44-FITC，CD45-FITC，CD80-FITC室溫下避光孵育30 min，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29，CD44，CD45，CD80的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用Student’st檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以Mean±S.D.表示，P<0.05表示結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的細(xì)胞形態(tài)

原代培養(yǎng)的兔ADSCs12小時(shí)開始逐漸貼壁，24小時(shí)完成貼壁， 其形態(tài)多呈短梭形或多角形。瓶?jī)?nèi)懸浮的球形或圓形的未貼壁細(xì)胞多為未除盡的血細(xì)胞，其在第一次更換培養(yǎng)液時(shí)即可除去。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，逐漸形成細(xì)胞集落(圖1)。第一代傳代細(xì)胞約2-4小時(shí)開始貼壁，12小時(shí)后開始快速增殖，約3天即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底壁(圖2)。實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示，兔的ADSCs可連續(xù)傳多代而保持原有的細(xì)胞形態(tài)和活力，適合作為組織工程的種子細(xì)胞。

圖1 原代培養(yǎng)的兔ADSCs(×200倍)

圖2 傳代培養(yǎng)的兔ADSCs(×200倍)

2.2 ADSCs的生長(zhǎng)曲線分析

結(jié)果顯示，多代ADSCs的生長(zhǎng)曲線形態(tài)相似(圖3)，都于第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6天時(shí)達(dá)到峰值，約從第7天開始進(jìn)入平臺(tái)期，呈典型的“S”形細(xì)胞成長(zhǎng)曲線。說明兔ADSCs具有相對(duì)穩(wěn)定的遺傳特性。

圖3 ADSCs的生長(zhǎng)曲線

2.3 ADSCs向胰島素分泌細(xì)胞的分化

顯微鏡下觀察顯示，在誘導(dǎo)分化過程中的第一階段ADSCs細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化；第二階段細(xì)胞形態(tài)變橢圓，且折光度增強(qiáng)；到第三階段時(shí)細(xì)胞周邊突觸逐漸縮短，中心漸變圓，14天時(shí)可見半懸浮的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。誘導(dǎo)14天時(shí)的雙硫腙染色結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞不著色；誘導(dǎo)組的細(xì)胞染色后呈棕紅色(圖4)，證明該細(xì)胞團(tuán)中有胰島素成分。

2.4 葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)果

圖4 14天時(shí)ADSCs的雙硫腙染色結(jié)果

兔ADSCs誘導(dǎo)后第7天時(shí)低糖刺激組和高糖刺激組胰島素表達(dá)均為陰性；第14天培養(yǎng)液中可以檢測(cè)到胰島素分泌，低糖刺激組胰島素分泌量為13.2±2.1 μIU/ml，高糖刺激組其值為14.1±1.7 μIU/ml，兩組之間無(wú)顯著性差異(t=1.622，P>0.05)；第21天時(shí)兩組胰島素濃度較第14天時(shí)均增高，其中低糖刺激組為17.1±2.2 μIU/ml，高糖刺激組為20.7±1.8 μIU/ml，兩組之間有顯著性差異(t=6.847，P<0.05)?？瞻讓?duì)照組均未檢測(cè)出胰島素。

2.5 ADSCs表面標(biāo)志檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果(圖5)可見，CD29和CD44表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為99.98%和98.88%，而CD45和CD80表達(dá)陰性，檢出率分別為1.32%和2.32%。

圖5 ADSCs的表面標(biāo)志的流式檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用了以尼克酰胺和GLP-1為主要試劑的誘導(dǎo)方案，將ADSCs誘導(dǎo)分化為胰島素樣分泌細(xì)胞。其中尼克酰胺是一種ADP-核糖合成酶抑制劑，能促進(jìn)內(nèi)分泌細(xì)胞的分化，其主要是通過它的代謝產(chǎn)物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)起作用。有研究表明尼克酰胺還可以促進(jìn)干細(xì)胞的分化，促進(jìn)胰島素分泌細(xì)胞的生成[2,3]。此外，尼克酰胺還能增加胚胎干細(xì)胞(ESCs)分化成胰島素分泌細(xì)胞的數(shù)量[4]。GLP-1是小腸L細(xì)胞分泌的一種腸降血糖素。它能刺激胰腺β細(xì)胞的分化和增殖，抑制β細(xì)胞凋亡[5]，增加胰島β細(xì)胞的數(shù)量，從而促進(jìn)胰島素的分泌。體外研究表明，GLP-1還可以誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞[6]、nestin陽(yáng)性的胰島源性干細(xì)胞[7]，使其分化為胰島素分泌細(xì)胞并分泌胰島素。

雙硫腙可與多種重金屬離子(鋅、鎘、鉛等)形成螯合物，是測(cè)定重金屬離子濃度的高靈敏試劑。胰島細(xì)胞由于含有鋅離子，能與雙硫腙螯合形成紫紅色的絡(luò)合物，呈陽(yáng)性反應(yīng)，因此可以用雙硫腙染色來鑒定胰島細(xì)胞[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過誘導(dǎo)14天后的ADSCs，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞團(tuán)能夠被雙硫腙特異染色，說明該經(jīng)過誘導(dǎo)14天后的ADSCs有細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞。而且葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)陽(yáng)性，說明ADSCs誘導(dǎo)分化的胰島素樣細(xì)胞可以分泌胰島素，并且隨著葡萄糖濃度的增加，其分泌量也明顯增加，證明ADSCs誘導(dǎo)后的胰島素樣細(xì)胞對(duì)糖刺激敏感，其胰島素的分泌受到外部環(huán)境中糖濃度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，誘導(dǎo)后的ADSCs具有類似體內(nèi)胰島細(xì)胞的功能，并通過血糖變化調(diào)節(jié)胰島素分泌。

本實(shí)驗(yàn)探討了CD29、CD44、CD45、CD80等相關(guān)表面抗原分子在ADSCs上的表達(dá)及其意義。CD29作為整合素家族之一，能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，參與免疫細(xì)胞黏附，為T細(xì)胞活化提供協(xié)同刺激信號(hào)；CD44是基質(zhì)細(xì)胞表面抗原；CD45是造血干細(xì)胞表面標(biāo)志[9]；CD80，即B7-1，是一種重要的共刺激分子，表達(dá)在活化B細(xì)胞及其他APC表面，是T細(xì)胞表面CD28分子和細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)的配體，具有協(xié)同刺激分子的作用。本實(shí)驗(yàn)中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs表面的抗原標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示CD29、CD44高表達(dá)，CD45、CD80表達(dá)呈陰性，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[10,11]。ADSCs高表達(dá)CD44，而不表達(dá)CD45說明ADSCs來自于基質(zhì)細(xì)胞，而非血液循環(huán)中的造血干細(xì)胞，這也與其組織來源相吻合。

與干細(xì)胞的其他來源組織相比較，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞易于體外培養(yǎng)，且可抑制免疫排斥反應(yīng)，是一種適合的組織工程種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)證明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞還能誘導(dǎo)分化為類胰島素分泌細(xì)胞，發(fā)揮胰島素降血糖的作用，這為今后脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于Ⅰ型糖尿病的治療提供了理論依據(jù)。

作者簡(jiǎn)介：郭偉(1981-)，男，在讀醫(yī)學(xué)博士，主要從事脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的分化研究。

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