絞股藍(lán)總苷對局灶性腦缺血大鼠腦組織含水量、腦梗死面積及腦組織形態(tài)學(xué)的影響

耿瑋崢，王 翰,姜 微，張大威，李天舒，呂文偉*

(1.延邊大學(xué)2011級臨床醫(yī)學(xué)系 2班，吉林 延吉133000；2.解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅八隊(duì) 臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，重慶 400038；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 超聲科，吉林 長春130033;4.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長春130021)

絞股藍(lán)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，性寒、味甘、微苦[1]，歸肺、脾、心、腎經(jīng)，有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清肺化痰、養(yǎng)心安神之功效。目前已分離鑒定出80余種皂苷,其中皂苷Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅶ的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、F2結(jié)構(gòu)相同。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，絞股藍(lán)皂苷對大鼠全腦缺血再灌注損傷及家兔急性不完全性腦缺血具有保護(hù)作用[2-3],對心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過建立腦缺血模型，研究絞股藍(lán)總苷對局灶性腦缺血大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 絞股藍(lán)皂苷(含量>90%，吉林大學(xué)白求恩制藥廠提供)，步長腦心通膠囊由陜西咸陽步長制藥有限公司提供。批號：130924。氯化三苯基四氮唑由上?；瘜W(xué)試劑公司提供。批號：20130910。

1.1.2 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，體重250-300 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號為SCXK-(吉)2013-0001。

1.1.3 儀器 CX21OL光學(xué)顯微鏡，日本奧林帕斯株式會(huì)社；LEICA QWIN圖象分析儀，泰盟科教儀器廠；CS501恒溫浴槽，南通科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；LDZ5-2型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)；DT-500型電子天平，常熟雙杰測試儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)的制備 取32只雄性大鼠，隨即分為4組，即模型組、陽性藥組(步長腦心通2.0 g·kg-1)及絞股藍(lán)總苷低、高劑量組(3.0和12.0 g·kg-1)。每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥七天，末次給藥1 h后，模型組、陽性藥組及絞股藍(lán)總苷各劑量組大鼠稱重后腹腔注射水合氯醛(0.3 g·kg-1)麻醉，仰臥位固定于鼠板上。剪開頸部正中皮膚，鈍性分離并暴露左側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，并在頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，左側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處剪口，插入頭端燒成圓鈍形直徑為0.25 mm的尼龍線，進(jìn)線長度約18-20 mm，在大腦中動(dòng)脈起始端堵塞大腦中動(dòng)脈，然后將頸總動(dòng)脈連同尼龍線一起結(jié)扎，逐層縫合后放回籠內(nèi)。術(shù)后37℃保溫，待動(dòng)物清醒后通過Zea Longa神經(jīng)功能學(xué)評分判定模型是否制備成功。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分的測定 按文獻(xiàn)所述，待大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分：0分，無神經(jīng)功能缺失癥狀,活動(dòng)正常；1分，輕微神經(jīng)功能缺損，對側(cè)前爪內(nèi)收、不能伸直；2分，，中度局灶性神經(jīng)功能缺損，前肢屈曲對側(cè)抵抗推力下降，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，重度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)身體偏癱側(cè)傾倒；4分，意識喪失，完全不能自發(fā)行走。

1.2.3 腦組織含水量測定 取32只雄性大鼠，分組、給藥及造模同前。大鼠麻醉后斷頭取腦,去除小腦、腦干及嗅球，電子分析天平稱取腦濕重，置于110℃烤箱中烘烤至恒重時(shí)稱取腦干重，按公式：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重，計(jì)算出腦組織的含水量。

1.2.4 腦梗死面積的測定 如前所述，大鼠麻醉后斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，從額板開始間隔2 mm冠狀切片，將切片置于1%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中(37℃)避光孵育30 min，然后置于10%甲醛中固定，正常組織染成紅色，梗死區(qū)呈現(xiàn)白色。用BL-2000圖象分析儀測定腦梗死面積。

1.2.5 大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察 腦組織經(jīng)10%福爾馬林固定48 h后，脫水、固定、石臘包埋、常規(guī)切片、HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1絞股藍(lán)總苷對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響模型組、步長腦心通組、絞股藍(lán)總苷3.0 g·kg-1組和12.0 g·kg-1組的大鼠神經(jīng)功能學(xué)指標(biāo)變化(P<0.05、P<0.01)，見表1。

表1 絞股藍(lán)總苷對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.2絞股藍(lán)總苷對局灶性腦缺血大鼠腦組織含水量、腦梗死面積的影響步長腦心通組，絞股藍(lán)總苷3.0 g·kg-1組大鼠腦組織的含水量明顯低于腦缺血模型組(P<0.05)，絞股藍(lán)總苷12.0 g·kg-1組的作用更加明顯(P<0.001)，絞股藍(lán)總苷 3.0 g·kg-1及12.0 g·kg-1組大鼠的腦梗死面積明顯低于腦缺血模型組(P<0.05,P<0.01)，結(jié)果見表2。

2.3絞股藍(lán)總苷局灶性腦缺血大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響1) 模型對照組：鏡下神經(jīng)元呈嗜伊紅深染的多角形或小圓形，可見嗜神經(jīng)現(xiàn)象。缺血區(qū)的腦組織結(jié)構(gòu)變得疏松，有篩狀軟化灶形成。腦組織嚴(yán)重水腫，部分神經(jīng)元變性壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞胞體固縮，胞核固縮甚至消失，胞漿濃染著色較深。2) 陽性藥步長腦心通組：鏡下可見嗜神經(jīng)現(xiàn)象。依然可見腦組織結(jié)構(gòu)疏松，篩狀軟化灶形成。部分神經(jīng)元呈變性壞死，表現(xiàn)為胞漿呈嗜伊紅，胞體為三角形，膠質(zhì)細(xì)胞增生。3) 絞股藍(lán)總苷低劑量組：鏡下可見嗜神經(jīng)現(xiàn)象。腦組織結(jié)構(gòu)疏松，可見篩狀軟化灶。腦組織水腫，神經(jīng)元變性壞死，壞死區(qū)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)疏松。4) 絞股藍(lán)總苷高劑量組：鏡下可見少數(shù)神經(jīng)元呈變性壞死改變，其胞體為三角形，胞漿呈嗜伊紅增強(qiáng)，這些神經(jīng)元散在分布，無腦組織結(jié)構(gòu)疏松及篩狀軟化灶形成。腦組織水腫，大多數(shù)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞分布結(jié)構(gòu)均無明顯異常。見圖1。

表2絞股藍(lán)總苷對局灶性腦缺血大鼠腦含水量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01 ，***P<0.001

圖1 絞股藍(lán)總苷對局灶性腦缺血大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響(HE,×100)

3 討論

腦缺血損傷主要指由于腦動(dòng)脈管腔狹窄或堵塞，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧,甚至水腫、壞死,進(jìn)而引起受損區(qū)域神經(jīng)功能缺損,出現(xiàn)受損神經(jīng)組織所支配側(cè)軀體肌張力減弱、癱瘓甚至死亡等行為障礙癥狀。在一定程度上反映腦組織損傷的程度。因此,神經(jīng)行為障礙癥狀常用作反映神經(jīng)功能狀況的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，絞股藍(lán)總苷可降低缺血大鼠的神經(jīng)學(xué)評分、腦梗死面積和腦組織含水量，說明絞股藍(lán)總苷可減輕缺血所造成的腦組織損傷和腦組織水腫，改善腦功能，對腦組織起保護(hù)作用。自由基介導(dǎo)的自由基連鎖反應(yīng)是腦缺血后繼發(fā)性損傷的重要環(huán)節(jié)之一[6]。缺血性腦血管病多為腦血管痙攣或栓塞引起腦組織缺血缺氧而致能量耗竭、興奮性氨基酸釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基的產(chǎn)生等因素，線粒體破壞，功能喪失，溶酶體膜裂解，大量溶媒溢入細(xì)胞漿，促使腦細(xì)胞發(fā)生自溶。導(dǎo)致腦組織水腫、神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，腦細(xì)胞的各種生物酶活性喪失或轉(zhuǎn)化為對腦細(xì)胞有損害的酶，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M鏡下可見缺血區(qū)腦組織神經(jīng)元呈變性壞死缺血性改變，表明腦缺血模型是成功的。步長腦心通組和絞股藍(lán)總苷低劑量組的神經(jīng)元變性壞死改變略有減輕。絞股藍(lán)總苷高劑量組神經(jīng)元變性壞死輕微，未見篩狀軟化灶，治療效果明顯。

綜上所述，絞股藍(lán)總苷對腦缺血具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抗氧化損傷來實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)：

[1]張 永，丁國華，張建鄂，等． 絞股藍(lán)總皂甙對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎組織結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響[J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，21(16):1745．

[2]田 鶴,張成英,陳前芬.絞股藍(lán)總皂苷對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1993,18(2):117.

[3]王竹筠,邱培倫.絞股藍(lán)總皂苷對家兔急性不完全性腦缺血的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1992,6 (3):204.

[4]周建正,肖 彬.絞股藍(lán)總皂苷和人參總皂苷對大鼠急性心肌缺血心臟舒張功能保護(hù)作用的比較[J].中國藥學(xué)雜志,1996,31(4):207.

[5]鄭奇斌,陳金和,吳基良.絞股藍(lán)總皂苷對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響[J].咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,16(2):89.

[6]Lewen A.Matz P,Chan PH.Free radical pathways in CNS injury[J].Neurotrauma，2000,17(10)：871.