漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚類化合物的動力學(xué)研究

，

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

目前，世界范圍內(nèi)溴酚類化合物的使用、工業(yè)廢水的排放等方式，都導(dǎo)致環(huán)境中溴酚類物質(zhì)逐漸增加.在工業(yè)中，2,4-二溴酚(2,4-DBP)是環(huán)氧聚合物的中間體.很多海產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加溴酚增加海鮮的特殊風(fēng)味[1-2].2,4,6-三溴酚(2,4,6-TBP)常用作木材防腐劑.很多海洋藻類中也發(fā)現(xiàn)了簡單的溴酚化合物的存在.溴酚在藻類體內(nèi)可以生物合成[3].海洋中的溴酚類有機化合物主要來源于海洋藻類次生代謝產(chǎn)物[4]，如腸鰓綱囊舌蟲體內(nèi)可以產(chǎn)生并釋放大量溴酚[5].漆酶是一種結(jié)合多個銅離子的蛋白質(zhì)，屬于銅藍(lán)氧化酶，存在于多種菇、菌及植物中，亦可存活于空氣中.大多數(shù)漆酶屬于單體酶[6].漆酶大多見于植物[7](如漆樹、1 000多種藻類[8])、真菌[9]、細(xì)菌、動物體[10]中.Bacillus sphaericus[11]等產(chǎn)漆酶的細(xì)菌不斷地被發(fā)現(xiàn)[12].真菌漆酶的催化氧化性能強于植物漆酶[13].漆酶不僅可以降解有機物[14]，還可能將有機物轉(zhuǎn)化成較大分子的有機物.漆酶能氧化苯酚類化合物產(chǎn)生自由基，進而引發(fā)自由基耦合反應(yīng)[15].酚類化合物的電勢電位為0.5～0.8 V，故漆酶可以催化氧化酚類化合物[16].漆酶催化轉(zhuǎn)化環(huán)境中存在的苯酚、苯胺以及其他有機污染物需要氧氣的存在.漆酶催化轉(zhuǎn)化酚類化合物的反應(yīng)主要包括漆酶催化氧化底物產(chǎn)生活性自由基和氧氣還原成水兩部分[17]，漆酶催化氧化酚類化合物產(chǎn)生的自由基很活潑，易引發(fā)一系列的后續(xù)反應(yīng)，如聚合反應(yīng)、解聚反應(yīng)、水解反應(yīng)以及歧化反應(yīng)等[15].還有研究認(rèn)為，漆酶催化酚類化合物產(chǎn)生半醌自由基，半醌自由基發(fā)生歧化反應(yīng)、互變異構(gòu)化等形成苯醌或其他有機物[15,18].

本研究主要以4-溴酚(4-BP)，2,4-DBP和2,4,6-TBP等為模型化合物，研究漆酶對溴酚的催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)動力學(xué)、pH和溫度對反應(yīng)的影響.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

漆酶，2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，4-BP，2,4-DBP，2,4,6-TBP購于美國Sigma Aldrich公司.4-BP，2,4-DBP，2,4,6-TBP做儲備液，色譜純甲醇做溶劑；實驗藥品及試劑使用前于4 ℃冰箱冷藏.

1.2 漆酶活性測定

采用ABTS法測定不同pH、不同溫度條件下漆酶的活性.用10 mmol/L磷酸緩沖溶液分別配制pH 5.0，6.0，7.0，8.0的0.01 mmol/L的ABTS溶液，加入一定量漆酶，使體系中漆酶質(zhì)量濃度為0.073 5 g/L，開始反應(yīng)，測定反應(yīng)溶液吸光度變化.在pH 7.0條件下，控制反應(yīng)體系溫度分別為15，25，35，45 ℃，測定反應(yīng)溶液吸光度的變化.

1.3 反應(yīng)動力學(xué)實驗

于反應(yīng)瓶中加入60 mL磷酸鹽緩沖溶液，加入一定量的溴酚底物，混勻，添加一定量的漆酶開始反應(yīng)，不同時間取樣.取反應(yīng)液0.5 mL，加入0.5 mL乙腈淬滅反應(yīng).用高效液相色譜-紫外分光光度法(HPLC-UV)分析樣品中溴酚殘留量.

1.4 pH影響實驗

25 ℃條件下，分別在60 mL pH 5.0，6.0，7.0，8.0磷酸鹽緩沖溶液中加一定量的溴酚底物，混勻，添加一定量的漆酶開始反應(yīng)，不同時間取樣.樣品預(yù)處理和分析同上.

1.5 溫度影響實驗

控制反應(yīng)體系溫度分別為15，25，35，45 ℃，向pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中加一定量的溴酚底物，混勻，添加一定量的漆酶開始反應(yīng)，不同時間取樣.樣品預(yù)處理和分析同上.

2 結(jié)果與討論

2.1 初始濃度對漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚化合物的影響

漆酶催化溴酚轉(zhuǎn)化產(chǎn)生自由基，自由基進而發(fā)生聚合反應(yīng)、解聚反應(yīng)等后續(xù)反應(yīng)，完成轉(zhuǎn)化過程[15,17].由圖1可見：在常溫下，pH 7.0緩沖體系中，三種溴酚都可以被漆酶催化轉(zhuǎn)化.在12 h反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)的進行，溴酚不斷減少.不同濃度漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚反應(yīng)的反應(yīng)動力學(xué)方程為Ct=5×10-6e-kt，符合假一級反應(yīng)動力學(xué)(Ct=C0e-kt)；擬合直線的斜率為假一級反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)k，k的值因漆酶初始濃度不同而不同.另外，隨著漆酶濃度的增大，三種溴酚的轉(zhuǎn)化速率常數(shù)也呈線性增大(圖2)，可見反應(yīng)體系中溴酚的濃度足夠大，使得該催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率與漆酶的濃度成正比關(guān)系.漆酶催化轉(zhuǎn)化4-BP，2,4-DBP和2,4,6-TBP的反應(yīng)速率常數(shù)分別為0.119 7，0.272 4，0.195 5 mL/(U·h).因此，漆酶催化轉(zhuǎn)化2,4-DBP的速率最快，4-BP稍慢.三者的轉(zhuǎn)化速率皆比漆酶催化轉(zhuǎn)化四溴雙酚A(k=0.39 mL/(U·h))和乙酰氨基酚(k=0.024 mL/(U·min))慢[19-20].

圖1 不同漆酶濃度下漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚動力學(xué)

圖2 反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)與不同漆酶濃度的關(guān)系

2.2 pH的影響

pH可以影響漆酶的活性，從而影響漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚的反應(yīng).圖3為pH對漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚的影響，由圖3可見漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚的反應(yīng)在酸性或堿性條件下皆表現(xiàn)為假一級反應(yīng).表1結(jié)果表明：漆酶能在較大的pH范圍內(nèi)保持相對較高的活性，但在酸性條件下活性相對較高.漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚的反應(yīng)在酸性條件下反應(yīng)更快.4-BP，2,4-DBP和2,4,6-TBP皆在pH 5.0表現(xiàn)出最大反應(yīng)速率.2,4,6-TBP在酸性條件下比4-BP和2,4-DBP轉(zhuǎn)化更快，在中性和堿性條件下結(jié)果相反.這可能由于pH不僅影響漆酶活性，還影響溴酚在反應(yīng)溶液中的存在形態(tài)，影響程度略有差異[19,21].底物與輔酶的結(jié)合受其解離程度影響，底物與輔酶的解離受活性中心的必需基團和催化基團的離子狀態(tài)有關(guān).4-BP，2,4-DBP和2,4,6-TBP的pKa值分別為9.17，7.79和6.08.當(dāng)溶液pH從8.0變到5.0時，解離態(tài)的4-BP，2,4-DBP和2,4,6-TBP逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槲唇怆x的溴酚分子，反應(yīng)速率加快，由此可推測溴酚分子更容易被漆酶催化轉(zhuǎn)化.當(dāng)pH升至8.0時，漆酶活性下降明顯，溴酚的轉(zhuǎn)化速率也隨之下降.

圖3 pH對漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚的影響

表1 不同pH條件下漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚的假一級反應(yīng)速率常數(shù)及漆酶活性的變化

2.3 溫度的影響

在不同溫度條件下，漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚的反應(yīng)遵循假一級反應(yīng)動力學(xué).由圖4和表2可見：在中性溶液且溫度較低時，漆酶的活性穩(wěn)定，可以較高效率地催化轉(zhuǎn)化溴酚.在不同溫度條件下，2,4-DBP反應(yīng)速率最快，2,4,6-TBP次之，4-BP最慢.在pH 7.0且溫度為15～45 ℃時，隨著溫度的升高，漆酶的活性逐漸升高，后出現(xiàn)下降趨勢.在低溫條件下，活化的漆酶分子相對較少，酶促反應(yīng)速率降低.溫度升高，活化的漆酶分子增多，反應(yīng)速率升高，當(dāng)溫度升高到一定值，酶蛋白出現(xiàn)熱變性現(xiàn)象，隨著溫度繼續(xù)升高，熱變性作用變成主要因素，反應(yīng)速率下降.我們實驗結(jié)果也表明，漆酶的活性在35 ℃達(dá)到最大值19.17 U/mL，45 ℃時活性下降.35 ℃和45 ℃時溴酚催化轉(zhuǎn)化速率接近.三種溴酚轉(zhuǎn)化有所差異，并未都在35 ℃時達(dá)到最大值.45 ℃時，2,4-DBP和2,4,6-TBP的轉(zhuǎn)化速率趨近于最大值，而4-BP還有繼續(xù)升高的趨勢.這主要是因為溫度不僅影響漆酶的活性，還影響反應(yīng)的活化能.可能是由于漆酶催化轉(zhuǎn)化三種溴酚的活化能不同，受溫度的影響有所差異.

圖4 溫度對漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚反應(yīng)的影響

表2 不同溫度下漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚假一級反應(yīng)速率常數(shù)及漆酶活性變化

表3 漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚反應(yīng)的活化能

2.4 漆酶催化溴酚轉(zhuǎn)化反應(yīng)的活化能

由表3數(shù)據(jù)(-lnk)和(1/T×103)，根據(jù)阿雷尼烏斯方程lnk=lnA-(Ea/RT)得出pH 7.0的條件下漆酶催化轉(zhuǎn)化溴酚反應(yīng)的活化能.4-BP，2,4-DBP和2,4,6-TBP反應(yīng)的活化能分別為37.07，19.18，24.00 kJ/mol.大多漆酶酶促反應(yīng)的活化能范圍在30～60 kJ/mol之間[22].反應(yīng)活化能低的反應(yīng)更容易發(fā)生，反應(yīng)速率更快.當(dāng)反應(yīng)的活化能稍低于100 kJ/mol時，較少的能量即可以使反應(yīng)進行[23].因此，漆酶催化轉(zhuǎn)化4-BP,2,4-DBP和2,4,6-TBP在常溫下均可進行.

3 結(jié) 論

在不同pH和不同溫度條件下，漆酶催化轉(zhuǎn)化4-BP，2,4-DBP和2,4,6-TBP的反應(yīng)皆遵循假一級反應(yīng)動力學(xué).pH影響漆酶活性的同時影響反應(yīng)速率.在偏酸性條件下，漆酶活性明顯較高，催化轉(zhuǎn)化溴酚的速率明顯高于偏堿性條件.2,4-DBP轉(zhuǎn)化反應(yīng)活化能最低，反應(yīng)最快，4-BP反應(yīng)活化能最大，反應(yīng)最慢，2,4,6-TBP介于二者之間.

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