超聲萃取-氣相色譜法測(cè)定黃瓜中殘留的百菌清和毒死蜱

，，

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

黃瓜是人們?nèi)粘Ｉ钪凶顬槠毡榈氖卟?，但是隨著需求量的增加，農(nóng)藥的使用量也在逐年增加,農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞[1-2].百菌清(CHT)和毒死蜱(CHP)是當(dāng)下使用的較多的殺菌、殺蟲(chóng)劑，我國(guó)陜西、江蘇省份相繼出現(xiàn)了果蔬農(nóng)殘超標(biāo)問(wèn)題[3-4]，隨著果蔬農(nóng)殘問(wèn)題的報(bào)道增多，果蔬的農(nóng)藥殘留問(wèn)題也逐漸被人們所重視.我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2012《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定黃瓜中百菌清最大殘留限量為5 mg/kg，ADI(每日允許攝入量)為0.02 mg/kg，毒死蜱最大殘留限量為0.1 mg/kg，ADI(每日允許攝入量)為0.01 mg/kg[5].超聲萃取法(Ultrasonication extraction)不僅安全、快速，而且高效、廉價(jià)，在處理多個(gè)領(lǐng)域物質(zhì)提取都有很好的應(yīng)用[6-8].超聲萃取法在處理果蔬農(nóng)藥提取中是一種比較理想的提取方式.利用有機(jī)溶劑正己烷、丙酮作為萃取劑單獨(dú)提取黃瓜中農(nóng)藥，效果不理想[9].Raymond等[10]提取蔓越莓植株中的百菌清和毒死蜱時(shí)，采用了正己烷與丙酮的混合溶液，農(nóng)藥的萃取效率達(dá)到95%以上.在黃瓜萃取液中含有大量葉綠素和植物酶，這些干擾物質(zhì)會(huì)影響農(nóng)藥的檢測(cè)，使得農(nóng)藥的回收率過(guò)高，而且也會(huì)對(duì)氣相色譜儀造成嚴(yán)重的污染[11-12].

傳統(tǒng)的層析柱填料主要有活性炭、氧化鋁、石墨化炭黑、硅膠和硅藻土等，有研究指出：利用活性炭和石墨化炭黑來(lái)去除萃取液中的葉綠素效果比較明顯，但是有機(jī)氯農(nóng)藥回收率較低[13-14].本實(shí)驗(yàn)提出了超聲波萃取，正己烷-丙酮混合液提取、層析柱分離的氣相色譜方法，能快速、準(zhǔn)確地測(cè)定黃瓜中百菌清和毒死蜱的殘留量.

1 材料與方法

1.1 儀 器

氣相色譜儀(Agilent，7890A)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi，R-215)、超聲振蕩儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，SK3200H)、循環(huán)式多用真空泵(河南太康科技器材廠，SHB-111A)、分析天平(德國(guó)賽多利斯，BS224s)、離心機(jī).

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品百菌清和毒死蜱均購(gòu)于Dr.Ehrenstrofer公司，純度均≥99.99%；中性三氧化二鋁，75～150 μm；弗羅里硅土，150～250 μm；層析柱規(guī)格為20 cm×1 cm(內(nèi)徑)；分析純正己烷、丙酮、無(wú)水硫酸鈉；哇哈哈礦泉水(杭州公司)；黃瓜購(gòu)買于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)之前已經(jīng)檢測(cè)百菌清和毒死蜱在黃瓜中的本底含量.

1.3 提取方法

黃瓜樣品(皮和肉):分別稱取10 g黃瓜皮和肉，分別放入研缽中，加入無(wú)水硫酸鈉5 g，研磨，然后轉(zhuǎn)移至100 mL具塞錐形瓶中，并用50 mLV(正己烷)∶V(丙酮)=60∶40混合溶劑清洗研缽，然后直接將溶劑倒入錐形瓶中，超聲萃取30 min后將萃取液轉(zhuǎn)移至250 mL圓底燒瓶；超聲萃取過(guò)程重復(fù)兩次，最后將兩次萃取液水浴(45 ℃)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 mL，待凈化.

1.4 凈化方法

凈化(黃瓜樣品)：將旋蒸后待凈化樣品加入層析柱中，填料從上至下為：適量無(wú)水硫酸鈉、5 cm硅膠、1 cm氧化鋁，用膠頭滴管將V(正己烷)∶V(丙酮)=90∶10混合淋洗液加入層析柱中進(jìn)行洗脫，并收集前20 mL洗脫液定容至25 mL，上機(jī)待測(cè).

1.5 色譜分析條件

將凈化定容之后的待測(cè)樣品進(jìn)氣相色譜儀檢測(cè)分析.色譜柱型號(hào)為HP-5(30 m×0.320 mm×0.25 mm)；Ni63電子捕獲檢測(cè)器(ECD)；升溫程序：起始溫度為80 ℃，保持2 min，然后以10 ℃的速度升溫至280 ℃，保持5 min，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為250 ℃和300 ℃；載氣為高純度氦氣(純度≥99.999%)，流速為1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL.

2 結(jié)果和討論

2.1 黃瓜中百菌清和毒死蜱的提取

添加百菌清、毒死蜱兩種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品到黃瓜樣品中，用V(正己烷)∶V(丙酮)=60∶40混合溶劑50 mL為萃取劑，分別超聲萃取15，30，60 min，萃取兩次，結(jié)果(表1)表明：超聲萃取60 min，兩次之后回收率偏高，可能提取出更多雜質(zhì)干擾標(biāo)樣；而超聲15 min，兩次萃取之后回收率偏低，萃取時(shí)間不夠，不能完全提取出兩種農(nóng)藥；然而超聲萃取30 min，兩次之后能夠達(dá)到96%以上的農(nóng)藥萃取效率，這與Raymond等[10,15]提取蔓越莓植株中的百菌清和毒死蜱的方法效率接近.所以最后我們選擇超聲萃取時(shí)間為30 min，萃取兩次.

表1 黃瓜樣品不同超聲萃取時(shí)間的回收率比較

2.2 黃瓜樣品凈化方法比較

為了最大效率去除萃取液中的葉綠素和植物酶等干擾物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)主要利用活性氧化鋁、硅膠和無(wú)水硫酸鈉三種物質(zhì)組合作為層析柱填料(其中無(wú)水硫酸鈉主要用來(lái)去除萃取液中多余水分).固定硅膠量和層析柱的直徑(1 cm)，改變氧化鋁的填充量，并用V(正己烷)∶V(丙酮)=90∶10的混合洗脫液洗脫萃取液，測(cè)定不同氧化鋁用量對(duì)百菌清和毒死蜱回收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2中.從表2可以看出：隨著氧化鋁填料高度的增加，百菌清和毒死蜱兩種農(nóng)藥的回收率均顯著下降.而硅膠和氧化鋁填料高度分別為5 cm和1 cm時(shí)，兩種農(nóng)藥回收率能滿足農(nóng)殘檢測(cè)的要求.確定本實(shí)驗(yàn)中農(nóng)藥的凈化層析柱填料從上至下為：適量無(wú)水硫酸鈉、5 cm硅膠、1 cm氧化鋁.

表2 層析柱中最佳填料比例

按照以上填料要求填充層析柱之后，該選用何種淋洗液也是我們需要解決的問(wèn)題之一.單一使用正己烷、丙酮或者乙酸乙酯等試劑進(jìn)行洗脫，農(nóng)藥的分離效果不明顯，而用V(正己烷)∶V(丙酮)=90∶10的淋洗液對(duì)分離百菌清、毒死蜱有很好的效果[16]，實(shí)驗(yàn)采用該混合溶液25 mL作為淋洗液，接取、定容至25 mL后氣相色譜法測(cè)定.百菌清和毒死蜱的回收率良好，分別能達(dá)到102%和98%，與傳統(tǒng)方法比較有了更好的效果[10,17].

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

依據(jù)以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)黃瓜和農(nóng)藥洗脫液中百菌清和毒死蜱進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別稱取五份10 g黃瓜皮和肉，分別加入1 mL和1 mg/L農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品.測(cè)定加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3.毒死蜱在黃瓜皮和肉中的平均回收率分別為104.1%和96.5%；百菌清在黃瓜皮和肉中的平均回收率分別為95.1%和92.5%.

表3 百菌清和毒死蜱在黃瓜皮和肉中回收率(n=5)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低檢出限

取一定量的10 mg/L百菌清毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成80，160，240，320，400 μg/L五種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩搖勻，按照氣相色譜儀檢測(cè)條件，以峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量做標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)百菌清和毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的線性回歸方程分別為Y2=41.8x+456.8和Y1=72.04x+2 996，線性范圍為80～400 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999和0.998(圖1)，滿足常規(guī)分析.將百菌清和毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)樣品逐級(jí)稀釋到峰高為基線噪音的3倍時(shí)，該質(zhì)量濃度為最低檢出質(zhì)量濃度，值分別為28 μg/L和33 μg/L.

圖1 百菌清和毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 百菌清、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品及其在黃瓜中的氣相色譜圖

2.5 氣相色譜圖

對(duì)比了百菌清和毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)圖譜和實(shí)測(cè)樣品圖譜情況，圖2(a)為百菌清和毒死蜱均為50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，圖2(b)為10 g黃瓜中加入百菌清和毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)(0.05 μg).標(biāo)準(zhǔn)圖譜中，百菌清和毒死蜱出峰時(shí)間分別為9.438和10.597，在同樣的色譜條件下，黃瓜樣品中兩種農(nóng)藥出峰時(shí)間分別為9.452和10.611，CHT和CHP兩種農(nóng)藥樣品的保留時(shí)間比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間延遲0.014 min，這可能是由于標(biāo)準(zhǔn)品和農(nóng)藥樣品中溶劑的差異或者儀器的穩(wěn)定性而導(dǎo)致兩種農(nóng)藥的出峰時(shí)間存在微小的差異.一般情況下，兩者差異控制在1%以內(nèi)則可以認(rèn)為是同一種物質(zhì).因此綜合分析，二者的出峰時(shí)間基本一致，能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)的定性要求.

3 結(jié) 論

建立了一種采用超聲萃取，利用復(fù)合填料層析柱高效去除葉綠素的干擾，最后經(jīng)過(guò)氣相色譜法測(cè)定樣品中的目標(biāo)物的檢測(cè)方法，得到黃瓜中百菌清和毒死蜱的平均回收率，分別為92.5%～95.1%和96.5%～104%，檢測(cè)限分別為28 μg/L和33 μg/L，質(zhì)量濃度在80～400μg/L范圍線性關(guān)系良好，線性回歸系數(shù)分別為0.999和0.998.檢測(cè)方法能夠同時(shí)檢測(cè)黃瓜中的百菌清和毒死蜱，與單一目標(biāo)物國(guó)標(biāo)測(cè)定法比較，該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確.本研究為黃瓜中百菌清和毒死蜱兩種農(nóng)藥的檢測(cè)提供了一種操作簡(jiǎn)便，溶劑消耗量少，能夠批量操作，對(duì)環(huán)境污染少的分析方法.

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