人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)條件優(yōu)化

張 琴，潘繼承，汪勁松

(湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 黃石 435002)

人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)條件優(yōu)化

張 琴，潘繼承，汪勁松

(湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 黃石 435002)

細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of the NF-κB ligand , RANKL)是TNF超家族的重要成員之一，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，通過(guò)與其受體核因子κB受體活化因子(RANK) 構(gòu)建的信號(hào)通路參與乳腺癌的發(fā)生、腫瘤骨轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等病理過(guò)程。人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域基因片段與原核表達(dá)載體pET-21b融合并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌Rosetta，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，誘導(dǎo)溫度，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 濃度，誘導(dǎo)時(shí)間及甘油濃度的條件優(yōu)化表明，當(dāng)IPTG的濃度為0.2 mmol/mL, 20 ℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h 時(shí)，甘油濃度為4%時(shí)，可在上清中獲得高效表達(dá)的pET-21b-RANKL融合蛋白，為該蛋白的進(jìn)一步純化及結(jié)構(gòu)與功能研究打下了良好的基礎(chǔ)。

人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域;大腸桿菌;重組蛋白;表達(dá)條件

細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand, RANKL)，是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員之一，源于滑膜組織[1，2]，主要表達(dá)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的表面，在淋巴組織(淋巴結(jié)、 胸腺、 脾、 胎肝)及骨組織(骨骼、骨髓)中含量高，而在心、胎盤(pán)、骨骼肌、胃和甲狀腺等非淋巴樣組織中僅有低度表達(dá)[3，4]。成骨細(xì)胞、 骨髓基質(zhì)細(xì)胞、 軟骨基質(zhì)周?chē)脑奸g充質(zhì)細(xì)胞和肥大型軟骨細(xì)胞T以及激活的淋巴細(xì)胞均表達(dá)RANKL[5]。

RANKL是由單個(gè)基因編碼。然而，可變剪接導(dǎo)致了三個(gè)亞型的表達(dá)。在人體中，有兩種亞型均為II型跨膜蛋白，分別含有317個(gè)氨基酸[6]和270個(gè)氨基酸，含有270個(gè)氨基酸的RANKL與含有317個(gè)氨基酸的區(qū)別僅在于具有較短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[7]。第三種亞型只含有243個(gè)氨基酸，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，而是一種可溶性蛋白，稱(chēng)為sRANKL[7，8]。每一種亞型只有當(dāng)他們各自聚合成同源三聚體以后才具有生物活性[9，10]。RANKL與其受體RANK以六聚體的形式結(jié)合并將信號(hào)傳遞至NF-κB信號(hào)通路，最終促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與成熟。因此，RANKL在破骨細(xì)胞增殖、分化、活化、存活以及腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列生理過(guò)程中起著十分重要的作用。

本研究首先通過(guò)基因工程技術(shù)將人RANKL基因克隆到原核表達(dá)載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中，誘導(dǎo)使其表達(dá)目的蛋白。通過(guò)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度、IPTG 濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、甘油濃度等五個(gè)影響因子對(duì)重組人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的菌株進(jìn)行可溶性表達(dá)及條件優(yōu)化，旨在為該蛋白進(jìn)一步的分離純化、功能鑒定和配體篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒與菌株

原核表達(dá)載體pET-21b、克隆菌株DH 5α、表達(dá)菌種Rosetta由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑及工具酶

Ex-Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶 NdeI、XhoI購(gòu)自Sigma公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；膠回收純化試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)購(gòu)自Amresco公司, 其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)在NCBI上人RANKL基因cDNA序列(GenBank 登陸號(hào): NM_003701.3)的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。

上游引物：RANKL-F: 5'-GGAATTCCATATGAGAGCAGAGAAAGCGATGGT-3'

下游引物：RANKL-R: 5'- CCGCTCGAGATCTATATCTCGAACTTTAAAAG-3'

由上海生工生物工程有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增片段 532 bp，其中在上游和下游引物5'端各引入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)和保護(hù)堿基。

1.4目的片段的擴(kuò)增與回收

采用人工合成的人RANKL 基因作為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為：RANKL-F (10

μ mol) 0.5 μL, RANKL-R (10 μ mol) 0.5 μL, cDNA模板0.5 μL, 超純水11 μL, Mix混合物12.5 μL.

PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性 30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min. PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分離，采用DNA 凝膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.5重組質(zhì)粒pET-21b-RANKL的構(gòu)建與鑒定

將回收的 PCR產(chǎn)物與pET-21b用Xho I和Nde I進(jìn)行雙酶切，電泳檢測(cè)，將目的條帶切膠過(guò)柱回收DNA片段。在T4連接酶作用下將RANKL基因與線性pET-21b載體連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET-21b-RANKL，轉(zhuǎn)化 DH 5α后利用Amp抗性平板篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)鑒定，以確定開(kāi)放閱讀框編碼正確。DH 5α的轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.6RANKL基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-21b-RANKL 轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組菌株 Rosetta/pET-21b-RANKL，挑取含陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒的單克隆菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基 (含Amp 100 μg/mL) 中，37℃活化過(guò)夜，再按1∶100 稀釋到LB 中，37℃培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8時(shí)，加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/mL , 于 37℃、200 rpm培養(yǎng)5 h , 將誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體置于冰水浴中超聲破菌， 12000 rpm離心10 min , 取上清和沉淀與上述菌體一起進(jìn)行15% SDS- PAGE電泳，分析目的蛋白的可溶表達(dá)情況，方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.7重組菌株原核表達(dá)條件優(yōu)化

將重組菌株Rosetta/pET-21b-RANKL按照1%接種量分別接種到含 100 mL LB液體培養(yǎng)基 (含Amp 100 μg/mL) 三角瓶中，做多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行以下條件優(yōu)化：

1) 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)

在37℃條件下培養(yǎng)至OD600分別為 0.4、0.6、0.8和1.0時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/mL , 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h.

2)溫度

在37 ℃條件下培養(yǎng)至 OD600為0.6時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/mL , 后將菌液均分為5份，分別于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和 37 ℃誘導(dǎo)6 h.

3)IPTG 濃度

在37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600為0.6 時(shí)，均分為6份，加入 IPTG 使其終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/mL , 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h.

4)誘導(dǎo)時(shí)間

在37 ℃條件下培養(yǎng)至 OD600為 0.6時(shí)，加入 IPTG 使其終濃度為1.0 mmol/mL , 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8 和10 h 取樣。

5)甘油含量

將重組菌株Rosetta/pET-21b-RANKL按照1%接種量分別接種到1個(gè)含 100 mL LB液體培養(yǎng)

基(含Amp 100 μg/mL)三角瓶中，于37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入IPTG使其終濃度為

1.0 mmol/mL , 分別加入甘油，使其占總體積的2%、4%、6%、8%、10% , 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6h.

上述條件下獲得的樣品，進(jìn)行15% SDS- PAGE電泳，分析目的蛋白的可溶表達(dá)情況，方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1pET-21b-RANKL表達(dá)載體PCR和酶切檢測(cè)

由圖1可以看出，表達(dá)載體PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，在550 bp左右的位置有清晰的特異性條帶；重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，得到大小約為550 bp和5300 bp的兩個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果一致(如圖2)；測(cè)序結(jié)果顯示RANKL基因開(kāi)放閱讀框連接正確，說(shuō)明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-21b-RANKL.

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組質(zhì)粒pET-21b-RANKL經(jīng)NdeI/XhoI酶切后的瓊脂糖凝膠電泳

2.2重組質(zhì)粒pET-21b-RANKL在Rosetta中的表達(dá)

由圖3中可以看出，Rosetta/pET-21b-RANKL重組菌株誘導(dǎo)后在20 kDa處有一條顯著表達(dá)條帶，與軟件預(yù)測(cè)大小相一致；經(jīng)超聲破碎后電泳發(fā)現(xiàn)重組目的蛋白主要形成包涵體，可初步確定重組目的基因?qū)崿F(xiàn)在E.coli 中的表達(dá)。

2.3重組菌株原核表達(dá)條件優(yōu)化

1)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響

選擇OD600為0.4-1.0的菌液分別進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，圖4所示為不同菌液OD600誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的差異性，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響較大，菌體的蛋白含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)菌液OD600為0.6時(shí)，誘導(dǎo)菌體蛋白可溶性表達(dá)量最大。

2)誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)圖5的 SDS-PAGE電泳圖可以看出，誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響較大。在20 ℃條件下震蕩培養(yǎng)6 h后，可獲得較高的可溶性目的蛋白表達(dá)量。

3)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響

由圖6可以看出，誘導(dǎo)兩小時(shí)后就有融合蛋白開(kāi)始表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性蛋白表達(dá)量逐漸提高，在6 h時(shí)表達(dá)量最大，繼續(xù)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間則蛋白表達(dá)量沒(méi)有繼續(xù)增加，而雜蛋白的量卻有所增加。

圖3 重組菌株Rosetta /pET-21b-RANKL 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 圖( M． 標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker; 1．未誘導(dǎo)上清; 2．未誘導(dǎo)沉淀; 3．誘導(dǎo)上清;4．誘導(dǎo)沉淀;黑色箭頭所示為目標(biāo)蛋白)

圖4 Rosetta /pET-21b-RANKL在不同OD600誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量的SDS-PAGE 圖( M． 標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker; 1-4．重組菌株OD600值分別為0．4、0． 6、0． 8、1． 0 誘導(dǎo)6h;黑色箭頭所指為目標(biāo)蛋白)

圖5 Rosetta /pET-21b-RANKL在不同誘導(dǎo)溫度下目的蛋白表達(dá)量的SDS-PAGE 圖( M． 標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker; 1-5．重組菌株在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30℃、37 ℃誘導(dǎo)6h;黑色箭頭所指為目標(biāo)蛋白)

圖6 Rosetta /pET-21b-RANKL在不同IPTG 濃度誘導(dǎo)下的蛋白表達(dá)量的SDS-PAGE 圖( M．標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker; 1-．重組菌株在誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、2、4、6、8、10 h 誘導(dǎo);黑色箭頭所指為目標(biāo)蛋白)

4)IPTG 濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)SDS-PAGE電泳圖可以看出，重組菌株Rosetta/pET-21b-RANKL蛋白表達(dá)量在終濃度為0.2 mmol/mL時(shí)，可溶性蛋白表達(dá)量最大，繼續(xù)增加IPTG濃度并未出現(xiàn)表達(dá)量增加(見(jiàn)圖7)。

5)甘油含量對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)SDS-PAGE電泳圖可以看出，甘油含量對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響較大。在加入2%甘油下誘導(dǎo)，蛋白表達(dá)量增加，在4%的甘油誘導(dǎo)條件下，可溶性蛋白表達(dá)量最大(見(jiàn)圖8)。

3 討論

RANKL及RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)目前已經(jīng)成為代謝性骨疾病領(lǐng)域最引人關(guān)注的科研熱點(diǎn)[12]。目前關(guān)于RANKL在骨代謝系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中的作用、介導(dǎo)骨吸收的信號(hào)傳遞過(guò)程以及它與其它骨吸收調(diào)節(jié)因子的調(diào)控關(guān)系等有待于深入研究。采用基因工程的方法制備RANKL蛋白質(zhì)可為其進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)所用的pET-21b即是一類(lèi)高效融合蛋白表達(dá)載體。本研究在設(shè)計(jì)RANKL引物時(shí)，在上游引物RANKL-F和下游引物RANKL-R的兩端加入了限制性內(nèi)切酶 Nde I和Xho I位點(diǎn)。通過(guò)酶切使目的片段和載體切成含粘性末端的DNA 片段，有利于下一步克隆連接。采用抗性篩選、PCR鑒定以及測(cè)序分析相結(jié)合的方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行陽(yáng)性篩選，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

圖7 Rosetta/pET-21b-RANKL在不同的IPTG誘導(dǎo)濃度下蛋白表達(dá)量的SDS-PAGE圖 (M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker;1-6.重組菌株在IPTG濃度為0.0 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM、1.0 mM誘導(dǎo)6 h;黑色箭頭所指為目標(biāo)蛋白)

圖8 Rosetta/pET-21b-RANKL在不同濃度甘油誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量的SDS-PAGE電泳圖(M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker;1-5;重組菌株在2%、4%、6%、8%、10%甘油;黑色箭頭所指為目標(biāo)蛋白)

利用基因工程法獲得大量廉價(jià)的肽類(lèi)物質(zhì)和稀有蛋白，能夠解決天然資源匱乏分離純化困難化學(xué)合成昂貴等問(wèn)題[13]。但是外源基因在異源表達(dá)時(shí)，受多種因素影響[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)時(shí)加入甘油含量等條件的摸索，找出最佳的誘導(dǎo)條件，對(duì)重組體在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效可溶性表達(dá)。當(dāng)菌液OD600為0.6時(shí)誘導(dǎo)菌體蛋白表達(dá)量最高，OD值過(guò)低或過(guò)高都不利于蛋白的表達(dá)。因此過(guò)早誘導(dǎo)造成生物質(zhì)和目的蛋白產(chǎn)量偏低，同時(shí)也增加了染菌的機(jī)會(huì)；誘導(dǎo)較晚雖可獲得高產(chǎn)量的生物質(zhì)，但細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的時(shí)間則減少，總的蛋白量仍然偏低。溫度可能是影響外源蛋白在大腸桿菌中獲得高水平表達(dá)的最重要因素之一[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明20 ℃時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高。溫度過(guò)高過(guò)低都會(huì)影響酶系統(tǒng)催化作用，從而降低目的蛋白的表達(dá)量。誘導(dǎo)時(shí)間的不同會(huì)影響到外源基因的表達(dá)以及工程菌的穩(wěn)定性和活性。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，目的蛋白的表達(dá)量逐漸增加，但是當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間大于6 h后，目的蛋白的表達(dá)量逐漸減少，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。當(dāng)IPTG 濃度為 0.2 m mol/mL時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高, 隨著 IPTG濃度增加目的蛋白表達(dá)量有下降趨勢(shì)，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響目的蛋白的表達(dá)量。IPTG濃度較低時(shí)蛋白表達(dá)量較低，可能是誘導(dǎo)劑對(duì)T7啟動(dòng)子的誘導(dǎo)強(qiáng)度較低所致；而較高濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響，可能是由于IPTG對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有一定的抑制作用導(dǎo)致[17]。甘油含量對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響較大。在甘油含量為4%時(shí)，可獲得較高的目的蛋白表達(dá)量，甘油含量過(guò)低或過(guò)高都可能會(huì)導(dǎo)致蛋白形成包涵體量的增加。

綜上所述，我們已經(jīng)成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-RANKL.通過(guò)對(duì)重組菌株Rosetta/pET-28b-RANKL蛋白表達(dá)條件優(yōu)化，確定了最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600及誘導(dǎo)時(shí)間分別為0.6和6 h, 最佳誘導(dǎo)溫度為20℃, 最佳IPTG濃度為0.2 m mol/mL, 最佳甘油含量為4%. 為該蛋白進(jìn)一步的分離純化、功能鑒定和配體篩選奠定了基礎(chǔ)。

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TheconstructionofprokaryoticexpressionvectorandoptimizationofexpressionconditionsoftheextracelluarDomainofHumanRANKL

ZHANG Qin,PAN Ji-cheng,WANG Jin-song

(College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002,China)

The receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) is an important member of the TNF superfamily, which is a type II transmembrane protein, and its cognate ligand, RANK (receptor activator of nuclear factor-kappa B) built the signaling pathway in the occurrence of breast cancer, bone metastases, osteoporosis, arthritis and other pathological processes. In this article, the extracellular domain of human RANKL gene were cloned into prokaryotic expression vector pET-21b and transformed into the expression bacteria E. coli Rosetta. We successfully constructed recombinant human RANKL gene Rosetta/pET-21b-RANKL. And it was induced to express the target protein. We optimized its expression conditions. When the IPTG concentration was 0.2 mmol/mL, the induced timing OD600 for 0.6, oscillation induced culture for 6 h in 20 ℃ and glycerol concentration for 4%, we can efficiently expressed the extracellular domain of human RANKL fusion protein (pET-21b-RANKL) in the supernatant. It provided a foundation for further purification of the protein and researched its structure function.

the extracellular domain of human RANKL;Escherichia coil;recombinant protein;expression conditions

2013—04—28

張琴(1987— )，女，湖北十堰人，碩士，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)與功能.

Q7

A

1009-2714(2014)01- 0048- 06

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.01.010