南瓜不同部位抗菌活性研究

向陽(yáng)，董昌金

(1.黃石市第二人民醫(yī)院, 湖北黃石 435002; 2.湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 湖北黃石 435002)

南瓜不同部位抗菌活性研究

向陽(yáng)1，董昌金2

(1.黃石市第二人民醫(yī)院, 湖北黃石 435002; 2.湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 湖北黃石 435002)

利用乙醇、甲醇和蒸餾水作提取劑分別提取南瓜不同部位(瓜皮、瓜肉、瓜瓤)中的抗菌物質(zhì)，并通過(guò)濾紙片法、瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定其抗菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，南瓜的甲醇提取液對(duì)枯草芽孢桿菌(G+)和大腸桿菌 (G-)的抑菌作用更為明顯，且瓜瓤中抗菌物質(zhì)含量最為豐富； 南瓜的甲醇-瓤提取液對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為10%，對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為15%； 初步鑒定瓜瓤中有良好抗菌活性的成分為脂溶性物質(zhì)。

南瓜；脂溶性物質(zhì)；抗菌活性

南瓜(Pumpkin )， 分類(lèi)上屬于葫蘆科、南瓜屬，是一年生蔓生草本植物, 原產(chǎn)墨西哥以及中美洲地區(qū)，明代傳入我國(guó)，世界各地普遍栽培。南瓜含有淀粉、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、B族維生素、維生素C和鈣、磷等成分; 同時(shí)，含有人體多種必需氨基酸，其中賴(lài)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸含量較高。南瓜不僅可以食用，而且還有一定的食療價(jià)值。據(jù)《滇南本草》記載：南瓜性溫，味甘無(wú)毒，入脾、胃二經(jīng)，能潤(rùn)肺益氣，化痰排濃，驅(qū)蟲(chóng)解毒，治咳止喘，療肺癰與便秘，并有利尿、美容等作用； 南瓜中含有能抑制微生物生長(zhǎng)的抗菌活性物質(zhì)，對(duì)真菌、細(xì)菌生長(zhǎng)有良好的抑制作用，作為天然食品抗菌劑有廣闊的應(yīng)用前景[1～3]。目前，國(guó)內(nèi)外在南瓜抗菌物質(zhì)的研究方面尚屬空白，抗菌物質(zhì)的提取分離是南瓜作為天然防腐劑應(yīng)用的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

成熟南瓜； PDA培養(yǎng)基；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2供試菌種

枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis，G+) ，大腸桿菌 (Escherichia coli, G-)。

1.3試劑及溶液

95%乙醇(分析純，武漢市中天化工有限公司)，甲醇(分析純，武漢市江北化學(xué)試劑廠)，蒸餾水。

1.4細(xì)菌菌懸液的制備

將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基活化后，分別用無(wú)菌生理鹽水配制成菌懸液。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用接種環(huán)挑取活化后的菌種于液體培養(yǎng)基內(nèi)搖勻，置于搖床內(nèi)培養(yǎng)18～24h后，將獲得的菌液逐步稀釋成10-1、10-2、10-3……10-7系列不同梯度的菌懸液。

1.5南瓜材料的處理

選擇皮較硬，成熟期長(zhǎng)，肉質(zhì)呈桔紅色的南瓜作為實(shí)驗(yàn)材料。先將南瓜洗干凈，分離其瓜皮、瓜肉、瓜瓤, 并置于55℃烘箱中烘干后粉碎，將瓜皮、瓜肉、瓜瓤不同部分的粉末分別做好標(biāo)記，并置于4℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.6南瓜抗菌物質(zhì)的提取

分別取3份低溫儲(chǔ)存的南瓜瓜皮、瓜肉、瓜瓤粉末(每份各取5g)：一份(瓜皮、瓜肉、瓜瓤)分別倒入裝有25mL蒸餾水的三角瓶中; 另2份分別置于裝有25mL甲醇、95%乙醇的三角瓶中。用錫箔紙封住瓶口，將這9個(gè)錐形瓶置于55℃的水浴鍋中浸提[4]。3h后進(jìn)行抽濾，收集濾液；將留下的濾渣再分別取25mL對(duì)應(yīng)的提取溶劑用同樣的方法重復(fù)浸提3次，合并用相同溶劑提取的提取濾液，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.7南瓜抗菌物質(zhì)抑菌實(shí)驗(yàn)

1.7.1 濾紙片法測(cè)定南瓜抗菌物質(zhì)的抑菌作用 將濾紙剪成半徑為6mm圓片，滅菌后分別浸泡在南瓜瓜皮、瓜肉、瓜瓤的提取液以及對(duì)照液(95%乙醇、甲醇和蒸餾水)中過(guò)夜[5]。無(wú)菌條件下，將PDA培養(yǎng)基倒平板，分別吸取0.2mL各供試菌液，加入到每個(gè)對(duì)應(yīng)平板后用涂布棒涂布均勻。每平板等距離放置3片浸泡南瓜提取液及對(duì)照的濾紙片，每個(gè)處理3次重復(fù)，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h.測(cè)定抑菌圈的大小，比較南瓜不同部位及不同提取方法的抑菌效果。

1.7.2 瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定南瓜抗菌物質(zhì)的抑菌活性 無(wú)菌條件下，將PDA培養(yǎng)基倒平板，分別吸取0.2mL各供試菌液，加入到每個(gè)對(duì)應(yīng)平板后涂布均勻。用無(wú)菌金屬打孔器( d =6mm) 在培養(yǎng)基中心打1 個(gè)小孔，分別吸取0.2mL南瓜不同部位的提取物加入孔內(nèi)，并設(shè)置提取溶劑作空白對(duì)照。將處理及對(duì)照培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h后用十字交叉法測(cè)量有效抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8南瓜提取液最小抑菌濃度的測(cè)定

選取試驗(yàn)效果最好的瓜瓤部分的提取液配制成2.5%、5%、10%、15%、20%、25%、30% 7個(gè)濃度梯度的稀釋液各50mL[6].無(wú)菌條件下，每個(gè)平皿內(nèi)分別取2mL不同濃度的提取液，倒入15mL已滅菌的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，靜置，冷卻、凝固后，再分別往平皿中加入0.2mL菌液，涂布均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)濃度梯度3個(gè)重復(fù)。48h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以不長(zhǎng)菌的提取液的最低濃度為最小抑菌濃度。

1.9南瓜瓜瓤不同成分抑菌效果比較

取5g瓜瓤粉用20mL無(wú)水乙醇50℃水浴1h進(jìn)行脫脂，離心，收集脫脂上清液及沉淀；將50mL無(wú)水乙醇加入沉淀中60℃下水浴4h后離心(4000r/min，10min)，收集上清液，重復(fù)抽提兩次，合并上清液；上清液中加丙酮至80%濃度，反復(fù)脫色，將沉淀用無(wú)水乙醇溶解離心，4000r/min下離心10min得膠質(zhì)沉淀，最后于45℃～60℃下進(jìn)行干燥處理得褐色膠質(zhì)狀糖蛋白提取物，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取物中蛋白質(zhì)含量，檢測(cè)提取物中是否含有蛋白質(zhì)成分[7，8]。最后，將所得的溶液和沉淀提取物分別進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。抗菌物質(zhì)的提取步驟如下：

2 結(jié)果與分析

選取皮較硬，成熟期長(zhǎng)，肉質(zhì)呈桔紅色的南瓜作為實(shí)驗(yàn)材料，采用不同提取方法(95%乙醇、甲醇和蒸餾水浸提)的提取液以及南瓜不同部位(瓜皮、瓜肉、瓜瓤)提取的抗菌物質(zhì)的抑菌效果進(jìn)行比較研究。

2.1南瓜抗菌物質(zhì)不同提取方法的抑菌效果

采用浸提的方法，分別用95%乙醇、甲醇(100%)和蒸餾水作溶劑對(duì)南瓜瓜皮、瓜肉、瓜瓤中的抗菌物質(zhì)進(jìn)行抽提，通過(guò)濾紙片法、瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定其提取液的抑菌作用(分別以95%的乙醇、甲醇和無(wú)菌蒸餾水做為對(duì)照)，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈的大小，取兩種方法的平均值來(lái)確定不同提取溶劑對(duì)抑菌效果的影響。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1：

表1 不同提取方法的抑菌效果

由表1可知，南瓜的甲醇提取液對(duì)兩種供試菌株(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)的抑菌作用明顯強(qiáng)于蒸餾水提取液和95%的乙醇提取液，95%的乙醇提取液抑菌效果十分不明顯。且在相同的提取方法中提取液對(duì)大腸桿菌(G-)比對(duì)枯草芽孢桿菌(G+)的抑菌作用更為明顯。而甲醇、95%的乙醇和蒸餾水(對(duì)照)對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均無(wú)抑制作用。

2.2南瓜不同部位提取液的抑菌效果

表1和圖1、圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示南瓜的甲醇提取液抑菌效果更為顯著。南瓜不同部位(瓜皮、瓜肉和瓜瓤)甲醇提取液的抑菌效果見(jiàn)表2.

表2 南瓜不同部位的甲醇提取液抑菌效果比較

由表2可知：南瓜的甲醇-瓤提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用最為顯著；南瓜的甲醇-肉提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌無(wú)明顯的抑菌效果；南瓜的甲醇-皮提取液對(duì)大腸桿菌有抑菌效果，但對(duì)枯草芽孢桿菌無(wú)明顯的抑菌效果。

圖1 南瓜提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

圖2 南瓜提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果

2.3南瓜瓜瓤甲醇提取液最低抑菌濃度測(cè)定

根據(jù)抑菌實(shí)驗(yàn)中抑菌圈的大小，選取成熟南瓜瓜瓤不同濃度的甲醇提取液做最低抑菌濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3：

表3 南瓜瓜瓤甲醇提取液最低抑菌濃度測(cè)定

由表3可知，南瓜瓜瓤甲醇提取液對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為10%，對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為15%.說(shuō)明該提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好，與之前濾紙片法、瓊脂孔擴(kuò)散法的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

2.4南瓜瓜瓤不同成分抑菌效果比較

南瓜瓜瓤主要成分為脫脂液和褐色膠質(zhì)狀物質(zhì)，該物質(zhì)經(jīng)考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法檢測(cè)鑒定其主要成分為糖蛋白。 通過(guò)濾紙片法可以比較瓜瓤脫脂液和糖蛋白提取液的抑菌效果(見(jiàn)表4)。

表4 南瓜瓜瓤不同成分對(duì)大腸桿菌的抑菌效果比較

瓜瓤糖蛋白對(duì)大腸桿菌無(wú)明顯抑菌效果，瓜瓤脫脂液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果顯著，初步鑒定瓜瓤中的脂溶性物質(zhì)有良好的抑菌效果。

3 討論

南瓜為一年生雙子葉草本植物，不僅有較高的食用、食療價(jià)值，而且還有防腐抑菌作用。不同的提取方法及南瓜不同部位對(duì)南瓜的抗菌效果有顯著的影響；南瓜的甲醇-瓤提取液對(duì)大腸桿菌(G-)、枯草芽孢桿菌(G+)的抑制作用最為顯著，作為天然食品防腐劑具有廣闊的應(yīng)用前景。瓜瓤糖蛋白對(duì)大腸桿菌無(wú)明顯抑菌效果，瓜瓤脫脂液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果顯著，初步鑒定瓜瓤中的脂溶性物質(zhì)有良好的抑菌作用。其有效抑菌成分的鑒定和抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步探索；同時(shí)，南瓜的甲醇-瓤提取液對(duì)大腸桿菌(G-)比對(duì)枯草芽孢桿菌(G+)的抑菌作用更為明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示南瓜的甲醇-瓤提取液中的抑菌成分對(duì)G+菌的抑菌效果較差，其原因需進(jìn)一步研究和分析。

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ThestudyforantisepticactivityofPumpkin

XIANG Yang1, DONG Chang-jin2

(1. The Second People's Hospital of Huangshi City, Huangshi 435002，China; 2. College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002，China)

In this study, the antibacterial material was extracted by 95% ethyl alcohol, methyl alcohol and distilled water in different parts of the ripe Pumpkin(pericarp, sarcocarp and melon pulp). Filter paper method and agar diffusion method were used to measure the antiseptic activity of antibacterial material. The trial results showed that inhibitory effect of the methyl alcohol extract of pumpkin on Bacillus subtilis (G+) and Escherichia coli (G-) was more obvious than others , and the antibacterial material content is most abundant in the melon pulp. The minimum inhibition concentration (MIC) of the antibacterial material to E. coli was 10%, and 15% to B. subtilis. Preliminary conclusion can be drawn that antibacterial activity components were liposoluble substance in the melon pulp.

pumpkin; Liposoluble substance; antiseptic activity

2014—07—20

向陽(yáng)(1962— )，男，湖北黃石人，副主任醫(yī)師。

Q53

A

1009-2714(2014)03- 0046- 05

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.03.011