分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌的構(gòu)建

，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032)

水蛭素是一種由65～66個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量約為7 KDa，是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑[1].天然水蛭素有十幾種變異體，其中研究最多且具有較好抗凝血酶活性的是HV1，HV2，HV3.由于三種水蛭素的提取部位不同使它們的活性存在差異，從口部提取的HV2活性最高，從頭部提取的HVl活性次之，從身體其他部位提取的HV3活性最低.由于天然醫(yī)用水蛭具有很好的開發(fā)價(jià)值，但在自然界中天然水蛭的來源十分有限，且提取成本高、效率低下，不利于大規(guī)模生產(chǎn).因而，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外醫(yī)藥界均著重研究通過基因工程的技術(shù)制備重組水蛭素[2].

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快速、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用和研究最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng).然而，由于外源蛋白在大腸桿菌中多以包涵體的形式表達(dá)，需要通過變性、復(fù)性等復(fù)雜步驟才可以恢復(fù)部分活性.在目的基因前面插入一段信號肽基因，可以利用信號肽引導(dǎo)外源蛋白到細(xì)胞周質(zhì)空間分泌表達(dá).不僅能使目標(biāo)蛋白以活性結(jié)構(gòu)生成，并且信號肽在分泌過程中可以自行切除，無需破菌，直接進(jìn)行周質(zhì)蛋白提取就能得到較高純度的目標(biāo)蛋白，從而簡化了后續(xù)的分離純化步驟[3-4].基于信號肽酶在切割信號肽的過程中與切割位點(diǎn)的氨基酸分子量有密切的聯(lián)系，本研究通過基因設(shè)計(jì)和重疊延伸(SOE)技術(shù)，將一種水蛭素的N端第一個氨基酸進(jìn)行突變，經(jīng)克隆、表達(dá)后，成功構(gòu)建突變型和天然型的兩種分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌.兩種重組水蛭素Ⅱ經(jīng)周質(zhì)蛋白提取和陰離子交換層析，通過電泳檢測和活性測定，比活性相同，突變型的表達(dá)量更高.

1 材 料

1.1 菌株與質(zhì)粒

pET-39b(+)購自Novagen公司；E.coliDH5α，BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 引物和酶類

引物合成和測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeI、BamH I購自Fermantas，pfuDNA聚合酶購自Sangon.

1.3 試 劑

B型小量質(zhì)粒快速提取試劑盒購自北京博大泰克生物科技有限公司；3S DNA Gel Purification Kit購自北京莊盟生物科技有限公司；100 bp Loading DNA Marker和Protein Molecular Low Marker購自Sangon；凝血酶和纖維蛋白原購自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 目的基因的獲得

按照DsbA信號肽基因序列以及HV2基因序列，用引物設(shè)計(jì)軟件DNASIS設(shè)計(jì)了以下6個片斷：

A: 5’GTTCATATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGC 3’

B1: 5’ACCCGACTCGGTGCAATCGGTGTAGGTAATCGCCGATGCGCTAAACGCTAAAACT 3’

B2: 5’ACCCGACTCGGTGCAATCGGTGTAGGTCGCCGCCGATGCGCTAAACGCTAAAACT 3’

S-1: 5’GTTCATATGAAAAAGATTTGGCTG 3’

H-1: 5’ATTACCTACACCGATTGCACC 3’

H-2: 5’TTTGGATCCTCATTGCAGGTACTCT 3’

其中：B1(B2)的5’端與HV2正義鏈5’端的30個堿基反向互補(bǔ)，在B2鏈中將HV2正義鏈5’端的前3個堿基進(jìn)行了突變；A片段的3’端與B1(B2)片段的3’端有18個堿基互補(bǔ)配對；S-1為A片段5’端的前24個堿基；H-1和H-2片段用于擴(kuò)增HV2序列.

首先在pfuDNA聚合酶的作用下，以A片段和B1(B2)片段的18個堿基反向互補(bǔ)配對，一步退火，延伸合成DsbA信號肽AB1(AB2)鏈.然后以化學(xué)合成的HV2全基因序列為模板，H-1和H-2為上下游引物PCR擴(kuò)增HV2片段.PCR參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入循環(huán)：94 ℃變性30 s，41 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，2個循環(huán)；再94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，26個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.

最后通過SOE-PCR法[5-6]分別將AB1(AB2)鏈和HV2序列拼接.以S-1和H-2為上下游引物，PCR擴(kuò)增全序列spHV2和spHV2mut，PCR條件參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入循環(huán)：94 ℃變性30 s，41 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，2個循環(huán)；再94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，26個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.全過程如圖1所示.

圖1 獲得全長目的基因的方法

2.2 工程菌的構(gòu)建

將2.1所得到的PCR產(chǎn)物和pET-39b(+)質(zhì)粒分別用NdeⅠ和BamHⅠ在37 ℃消化2 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和3S DNA Gel Purification Kit純化回收，回收產(chǎn)物用T4 DNA ligase在4 ℃冰箱中連接過夜后，用CaCl2法轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coliDH5α.挑選能在卡那霉素抗性LB固體培養(yǎng)基上生長的單克隆，以T71測序引物、H-2作為正反向引物，菌落PCR篩選出陽性克隆子，送金斯瑞生物科技有限公司測序.將經(jīng)測序證實(shí)的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)，得到兩種基因工程菌.

2.3 重組水蛭素Ⅱ的初步純化

采用“冷休克”法從細(xì)胞周質(zhì)空間中提取兩種目標(biāo)蛋白[7]，具體流程：挑取2.2中經(jīng)篩選后的陽性克隆接種于3 mL含50 μg/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)中，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日按1%接種量轉(zhuǎn)接于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.3～0.5時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG[8]，28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h.取適量發(fā)酵液于4 000 r/min離心15 min，收集菌體，用含20%蔗糖的20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液，重懸菌體，冰浴30 min；加4倍體積蒸餾水，冰浴30 min；4 000 r/min離心10 min，收集上清.

將上述收集的上清溶液，以2 mL/min的速度上樣于經(jīng)10 mmol/LTris-HCl(pH8.0)平衡過的Q-Sephorase FF柱中，用50 mL含10 mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行預(yù)洗脫；接著用50 mL含40 mmol/L 的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，得到兩種目標(biāo)蛋白[9-10].經(jīng)Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析[11]，初步確定純化效率.

2.4 重組水蛭素Ⅱ的抗凝血活性測定

按Markwardt凝血酶滴定法[12]對兩種蛋白的活性進(jìn)行測定.取1支小試管加入0.5%纖維蛋白原溶液200 μL，再加50 μL上述2.3中的兩種樣品，混勻，滴加100 NIH/mL凝血酶5 μL搖勻，37 ℃恒溫水浴下1 min不凝，再滴加相同濃度凝血酶5 μL，直到纖維蛋白原溶液在1 min內(nèi)凝結(jié)，所用凝血酶總量，再乘以20即可計(jì)算出樣品每毫升活性.

2.5 PCR和SOE產(chǎn)物結(jié)果

以HV2全合成基因序列為模板，H-1和H-2分別為上下游引物，用pfuDNA聚合酶經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到HV2片段；A片段和B1(B2)片段在pfuDNA聚合酶作用下合成AB1(AB2)鏈；最后，以S-1和H-2分別為上下游引物，用pfuDNA聚合酶經(jīng)SOE-PCR，將AB1(AB2)鏈和HV2基因序列拼接，得到兩個基因片段spHV2和spHV2mut，經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見大小分別為200，100，270 bp左右的特異性擴(kuò)增條帶，與理論大小相符，結(jié)果見圖2.

1，3，6-DNA Marker；2-HV2基因；4，5-AB1片段，AB2片段；7，8-兩種目的產(chǎn)物

基因片段spHV2和spHV2mut分別經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后，重組于載體pET-39b(+).轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，用T71測序引物和H-2分別作為正反向引物經(jīng)菌落PCR，擴(kuò)增得到與目的基因大小略大的PCR片段，初步說明兩個目的基因已經(jīng)分別插入pET-39b(+)中.經(jīng)測序證實(shí)，確定pET39-spHV2和pET39-spHV2mut構(gòu)建成功.質(zhì)粒圖譜見圖3.

圖3 重組表達(dá)載體pET39-SHV2圖譜

2.6 重組水蛭素Ⅱ的初步純化結(jié)果

工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用“冷休克”法從細(xì)胞周質(zhì)空間中提取目標(biāo)蛋白，經(jīng)Q-Sephorase FF柱純化后得到純度較高的目標(biāo)蛋白HV2和HV2mut.再經(jīng)上樣—預(yù)洗—洗脫后，各個部分經(jīng)Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果見圖4，5.

M-protein marker；1，2，3—100 mmol/L NaCl 洗脫；4—40 mmol/L NaCl 洗脫；5—10 mmol/L NaCl 洗脫；6—穿透液； 7—周質(zhì)提取液

M-protein marker；1，2-100 mmol/L NaCl 洗脫；3-40 mmol/L NaCl洗脫；4-10 mmol/L NaCl洗脫；5-穿透液；6-周質(zhì)提取液

2.7 重組水蛭素Ⅱ的活性測定結(jié)果

采用Markwardt凝血酶滴定法測定重組水蛭素HV2和HV2mut,結(jié)果顯示：HV2活性為500 ATU/mL，HV2mut活性為900 ATU/mL，兩者比活性相同，因此突變型的表達(dá)量約為天然型的2倍.

3 結(jié) 論

水蛭素作為一種凝血酶有效而特異的抑制劑，在動物模型實(shí)驗(yàn)及臨床研究中能夠有效地預(yù)防動、靜脈血栓的形成及彌散性血管內(nèi)凝血，是一種很好的溶栓藥物輔助劑.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，重組水蛭素的制備已成為熱點(diǎn).在大腸桿菌周質(zhì)空間的分泌表達(dá)不僅有利于表達(dá)蛋白的純化，更重要的是蛋白在分泌過程中能正確折疊，從而獲得有活性的目標(biāo)蛋白.信號肽可以引導(dǎo)外源蛋白從胞內(nèi)向周質(zhì)空間分泌，在分泌過程中信號肽酶的切割位點(diǎn)多為小分子氨基酸.基于在質(zhì)粒載體pET-39b(+)中，DsbA信號肽酶在切割時的天然識別位點(diǎn)為Ala-Ala，為了提高DsbA信號肽酶的切割效率，增加目標(biāo)蛋白的周質(zhì)空間表達(dá)量.本研究采用SOE技術(shù)將水蛭素Ⅱ的N端第一個氨基酸Ile的基因序列突變?yōu)锳la的基因序列，并將突變和未突變的水蛭素Ⅱ基因與DsbA信號肽基因融合，實(shí)現(xiàn)兩種水蛭素Ⅱ在大腸桿菌周質(zhì)空間的分泌表達(dá).通過電泳檢測和活性測定，與天然型水蛭素Ⅱ相比，突變型的周質(zhì)空間表達(dá)量提高了近一倍.本研究制備了兩種分泌型水蛭素工程菌，簡化了后續(xù)的分離純化步驟，有望在進(jìn)一步完善后進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化，為臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供大量的重組蛋白.

參考文獻(xiàn)：

[1]張士斌．水蛭素的基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用展望[J]．北京醫(yī)學(xué)，2006，28(3)：173-177．

[2]高雪濤，段志強(qiáng)，高晶．水蛭素的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J]．黑龍江醫(yī)藥，2003，16(1)：38-39．

[3]鄭斌，詹希美．信號肽序列及其在蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用[J]．生物技術(shù)通報(bào)，2005，16(3)：38-42．

[4]于真真，林陳水．色氨酸酶在大腸桿菌周質(zhì)中的分泌融合表達(dá)[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36(5)：547-551．

[5]RYAN W B， TIZIANA M C， VERONICA G C． SOE-LRed： a simple and time-efficient method to localize genes with point mutations onto the Escherichia coli chromosome[J]． Journal of Microbiological Methods，2011，84：479-481．

[6]靳傳濤，林陳水．HV-1蛋白酶在大腸桿菌中的表達(dá)[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37(5)：538-541．

[7]RAMAKRISHNAN N R， JOO S T， MOHD S M， et al． Optimization of osmotic shock process variables for enhancement of the release of periplasmic interferon-α2b from Escherichia coli using response surface method[J]．Process Biochemistry，2010，45：196-202．

[8]洪敏，趙春田，張正波，等．L-天冬氨酸α-脫羧酶工程菌株的構(gòu)建及其培養(yǎng)條件研究[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(3)：252-246．

[9]邵雷，周長林，范維，等．發(fā)酵液中重組水蛭素的分離純化[J]．中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34(3)：268-271．

[10]SHI Bing-xing， LI Jing-chuan， YU Ai-ping， et al． Two-step ion-exchange chromatographic purification of recombinant hirudin-II and its C-terminal-truncated derivatives expressed inPichiapastoris[J]． Process Biochemistry，2006，41：2446-2451．

[11]HERMANN S． Tricine-SDS-PAGE[J]． Nature Protocols，2006，1(1)：16-22．

[12]MARKWARDT F． Hirudin as an inhibitor of thrombin[J]． Methods Enzymol，1970，69： 924-932．