生物活性導向分離海洋真菌Alternaria sp.MNP801次級代謝產(chǎn)物

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(1.浙江工業(yè)大學 藥學院,浙江 杭州 310032；2.浙江工業(yè)大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310032)

海洋環(huán)境同陸地環(huán)境不同，高壓，低營養(yǎng)，低溫，無光照和高鹽等，使海洋真菌能產(chǎn)生一些陸地真菌不同的活性次級代謝產(chǎn)物.目前，我們已發(fā)現(xiàn)的新化合物的類型包括聚酮、肽類、生物堿、萜類、甾體等，其中的一些表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化等生物活性[1-3].海洋微生物次級代謝產(chǎn)物眾多，快速篩選難度較大，運用簡單的高通量篩選過程無法對含有復雜且微量的活性代謝產(chǎn)物進行篩選，限制了微生物活性次級代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用，因此本研究設計了雙模型生物活性導向篩選方法[4]，利用紫外液相譜圖(HPLC)給出海洋真菌微量代謝產(chǎn)物HPLC-UV譜的同時，利用抗氧化和抗腫瘤雙模型生物活性譜導向篩選活性代謝產(chǎn)物,建立紫外分析液相色譜圖(HPLC-UV)和抗腫瘤(MTT)、抗氧化(DPPH)生物活性相對應的導向分離圖譜[5].該篩選方法成功應用于海洋鏈格孢屬真菌Alternariasp. MNP801的代謝產(chǎn)物研究中，從菌體浸膏中導向分離到3個化合物：5α，8α-表二氧麥角甾-6，22-二烯-3β醇(Ⅰ)、氧雜蒽酮(Ⅱ)、硬脂酸(Ⅲ).化合物Ⅰ為首次從海洋鏈格孢屬真菌中分離得到的化合物，驗證試驗表明化合物Ⅰ對腫瘤細胞H460，3T3，PC12，U937具有強的抑制活性，其IC50值分別為51.26，41.26，8.7和14.6 μg/mL.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與材料

奧林巴斯CK40倒置顯微鏡；奧賽飛世爾科技Revco Elite Ⅱ二氧化碳培養(yǎng)箱、Multiskan MK3型酶標儀；奧賽飛世爾生物化學制品有限公司RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、無支原體牛血清(FBS)；Sigma公司四甲基偶氮唑鹽(MTT)；百靈威公司1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)；杭州昊天生物技術(shù)有限公司二甲基亞砜(DMSO)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

實驗所用海洋真菌采自中國東海海域40 m深處海水(東經(jīng)122.689 6度，北緯31.362 2度，臺州科技局協(xié)助提供).經(jīng)18sRNA基因序列，鑒定為海洋鏈格孢屬(Alternariasp.)命名為Alternariasp. MNP801.

人宮頸癌HeLa細胞、肺癌H460細胞、神經(jīng)癌PC12細胞、淋巴癌U937細胞來自浙江大學生命科學院和浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院環(huán)境毒理實驗室.

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方

PDA海水培養(yǎng)基(1 L)：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖和20 g瓊脂，0.6 L人工海水，0.4 L去離子水，pH自然.

人工海水液體培養(yǎng)基(1 L)：10 g葡萄糖，2 g蛋白胨，1 g酵母膏，0.6 L人工海水，0.4 L去離子水，pH自然.

人工海水(1 L)：24.477 g NaCl，4.981 g MgCl2·6H2O，3.917 g Na2SO41.102 g CaCl2·H2O，0.664 g KCl，0.192 g NaHCO3，0.096 g KBr, 0.026 g H3BO3，0.024 g SrCl2，0.004 g NaF，蒸餾水1 L.

1.2.2 發(fā) 酵

將生長良好的Alternariasp. MNP801接種到100 mL人工海水液體培養(yǎng)基，28 ℃，200 r/min，震蕩培養(yǎng)2 d；然后轉(zhuǎn)接到600 mL人工海水液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，28 ℃，200 r/min，震蕩培養(yǎng)7 d，共培養(yǎng)110 L.

1.2.3 提 取

抽濾分離菌體和發(fā)酵液，菌體超聲破碎，經(jīng)冷凍干燥后甲醇浸泡，減壓濃縮回收溶劑得到菌體粗浸膏約55 g.

1.2.4 菌體浸膏HPLC條件的確定

HPLC色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18，5 μm，4.6×250 mm，流動相為m(乙腈)∶m(水)=90∶10，檢測器為紫外檢測器UV203 nm，流速為1.0 mL/min.

1.2.5 HPLC-DPPH自由基清除活性聯(lián)用

采用DPPH自由基(1，1-二苯基-2-苦肼基自由基)清除體系來測定樣品的抗氧化能力[6-7].按照1.2.4條件，HPLC分離樣品，96孔板取樣(20 s/孔)，揮干溶劑，每孔中加入300 μL甲醇溶解制母板，每孔取100 μL至兩塊子板中.其中一塊加入0.1 mmol/L的DPPH溶液100 μL，振蕩30 s，室溫孵育20 min后492 nm波長下酶標儀測定吸光值(Ap)；另一塊不加DPPH溶液，加入100 μL甲醇作為空白吸收(Ac=100 μL樣品+100 μL甲醇)，同時測定加100 μL DPPH和100 μL甲醇的吸光值(Amax=100 μL DPPH+100 μL甲醇).陽性對照樣Vc，清除率計算公式為

清除率(%)=[1-(Ap-Ac)/Amax]×100

1.2.6 HPLC-MTT抗腫瘤活性聯(lián)用

按照1.2.4條件，HPLC分離樣品，按照1.2.5條件，母板移出樣品制備另一塊子板，揮干溶劑，紫外燈下照射30 min滅菌待測.

采用MTT法[7-9]進行對H460細胞進行體外抑制實驗.取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加2×104個/mL的腫瘤細胞(含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液)，在37 ℃，5%的二氧化碳，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h讓細胞貼壁.去除培養(yǎng)液，從HPLC接收的96孔板母板中吸取200 μL(0.1%DMSO為溶媒的培養(yǎng)液)到接有細胞的96孔板中，培養(yǎng)48 h后，加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL的0.01 M PBS溶液)到96孔板的每孔中，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液(懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液).子板每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，490 nm波長下酶標儀測定吸光值.抑制率計算公式為

抑制率(%)=[1-A490(加藥)/A490(空白)]×100

單體化合物驗證試驗采用MTT法對H460，3T3，PC12和U937四株細胞株進行，臨床用藥VP16為對照組.

1.2.7 活性代謝產(chǎn)物定向分離

基于菌體浸膏雙模型活性分子導向識別譜(圖1)，可以發(fā)現(xiàn)19 min后的組份自由基清除率不理想，因此不考慮分離該部分的組分，圖1(b，c)中標記星號的譜峰與其他譜峰相比較顯示了具有DPPH自由基活性，同時還有良好的抗H460腫瘤細胞生長，故采用制備型HPLC進行導向分離，分別從3組譜峰中分離制備得到化合物Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ.

圖1 生物活性導向識別譜

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ為白色針狀結(jié)晶，25 mg，熔點175～177 ℃.EI-MS:[M+H]=429；化合物的核磁數(shù)據(jù)如下：1H-NMR(500 MHz, CDCl3)δH：0.819(3H, d,J=6.3 Hz,)，0.826(3H, s)，0.833(3H, d,J=6.3 Hz)，0.893(3H, s)，0.911(3H, d,J=6.9 Hz)，1.002(3H, d,J=6.6 Hz)，3.979(1H, m)， 5.178(1H,dd,J=12.0, 7.8 Hz)，5.209(1H, dd,J=12.0, 7.8 Hz)， 6.244(1H, d,J=8.4 Hz)，6.505(1H, d,J=8.4 Hz).13C-NMR(125 MHz, CDCl3)δC：12.89，17.57，18.18，19.64，19.95，20.65，20.89，23.42，28.63，30.11，33.08，34.72，36.99，39.37，39.71，42.80，44.58，51.14，51.71，56.24，66.48，79.45，82.18，130.76，132.34，135.12，135.43.查文獻比較分析[10-11]確定為5α，8α-表二氧麥角甾-6，22-二烯-3β醇(5α,8α-epidioxy-ergosta-6, 22-diene-3β-ol)為首次從海洋鏈格孢屬真菌中分離得到的化合物，其結(jié)構(gòu)式為

化合物Ⅱ為白色針狀晶體，20 mg，熔點174 ℃.EI-MS：[M+H]=197；化合物的核磁數(shù)據(jù)如下：1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δH：7.363～7.416(t,2H)，7.487～7.518(d,2H)，7.707～7.764(t,2H)，8.337～8 369(d,2H).13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δC：112.03，116.7，117.88，132.81，135.09，152.93，171.91.查文獻比較分析[12-13]，該化合物為夾氧蒽酮(xanthone)，其結(jié)構(gòu)式為

化合物Ⅲ為白色固體油狀物，55 mg，熔點70 ℃.EI-MS譜峰：55，67，87，97，115，129，143,157,171,185,199,213,227,241,256，284.與文獻數(shù)據(jù)[14]比較分析，該化合物鑒定為硬脂酸，即十八碳酸(stearic acid)，其結(jié)構(gòu)式為

2.2 化合物的生物活性驗證試驗

2.2.1 化合物對DPPH自由基的清除活性

生物活性驗證實驗，化合物Ⅰ—Ⅲ對DPPH自由基清除率見表1.

表1 化合物Ⅰ—Ⅲ的自由基清除率1)

通過測定化合物Ⅰ—Ⅲ對DPPH自由基的清除率活性，與陽性對照品Vc相比，三個化合物具有較弱的抗氧化活性，這可能與每個譜峰中包含若干具有協(xié)同抗氧化活性化合物有關(guān)，而從每個譜峰中分離的單體化合物所具有的抗氧化活性并不具有強的活性.

2.2.2 化合物Ⅰ對腫瘤細胞生長的抑制活性

生物活性驗證實驗，化合物Ⅰ抑制腫瘤細胞生長，IC50值見表2．

表2 化合物Ⅰ對腫瘤細胞生長的IC50值1)

化合物Ⅰ對腫瘤細胞H460，3T3，PC12，U937顯示了較好的抑制活性，對PC12，U937腫瘤細胞有較強的特異性，與生物活性導向分離測試結(jié)果相一致，說明該篩選方法有效，可行.化合物Ⅱ—Ⅲ由于在抗氧化活性測試中重復測試損耗樣品導致無法完成抗腫瘤活性測試.

3 結(jié) 論

本實驗設計了雙模型生物活性導向分離方法，利用紫外液相譜圖(HPLC-UV)給出海洋真菌微量代謝產(chǎn)物HPLC-UV譜的同時，根據(jù)需要進行多子板活性模型篩選給出活性圖譜，將HPLC圖譜與活性圖譜一一對應即可起到篩選作用，同時起到生物活性成分測定導向分離的作用，實現(xiàn)后續(xù)在高效液相色譜柱中直接引導活性代謝產(chǎn)物的導向分離純化，該篩選方法成功應用于海洋真菌Alternariasp.MNP801的代謝產(chǎn)物研究中，從菌體浸膏中定向分離到化合物Ⅰ—Ⅲ，分別為5α，8α-表二氧麥角甾-6，22-二烯-3β醇(Ⅰ)，氧雜蒽酮(Ⅱ)，硬脂酸(Ⅲ).化合物Ⅰ為首次從海洋鏈格孢屬真菌中分離得到的化合物，驗證實驗表明化合物1對腫瘤細胞H460，3T3，PC12，U937顯示了較好的抑制活性，其IC50值分別為51.26，41.26，8.7，14.6 μg/mL.實踐證明：篩選海洋真菌代謝產(chǎn)物和分離海洋天然產(chǎn)物活性成分，該篩選方法是有效、可行的，但同時也需要注意到組分間的生物活性協(xié)同作用對驗證實驗結(jié)果的影響，為今后海洋天然產(chǎn)物的導向分離研究奠定實驗基礎.

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