黃連醇提物對真菌幾丁質(zhì)合酶的抑制作用

，， ， ，倩雯，

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032)

近年來，真菌感染、特別是條件致死性真菌感染發(fā)病率在長期應(yīng)用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑和化療后的病人中逐年增高,已成為近代醫(yī)學(xué)對腫瘤、白血病、糖尿病、放射病和燒傷病人治療中的疑難問題,越來越受到醫(yī)學(xué)界的重視[1].另一方面，目前臨床上使用的抗真菌藥物種類有限，而且多數(shù)有副作用和抗藥性問題，迫切需要開發(fā)新型高效廣譜并具有選擇性毒力的抗真菌藥物[2].由于真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)成分是真菌特有的，動植物均不含有幾丁質(zhì)，因此幾丁質(zhì)合成酶是抗真菌劑的理想靶標(biāo)之一[3-4].黃連是中國的傳統(tǒng)中草藥，應(yīng)用廣泛，常用于治療濕熱內(nèi)蒸、百日咳、痞滿脹悶、泄瀉痢疾、消渴、膽囊炎、癰疽腫毒、中耳炎、急性扁桃體炎、大葉性肺炎、煩躁嘔逆、流行性腦脊髓膜炎等,且具有抗放射及促進(jìn)細(xì)胞代謝的作用[5-6].本研究采用酵母細(xì)胞作為篩選模型對98種常用中草藥的抗真菌活性進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)黃連醇提液能挽救酵母在CFW(Calcofluor white)抑制濃度下的生長，黃連醇提液處理后的酵母細(xì)胞幾丁質(zhì)含量明顯降低，表明黃連醇提液具有抑制酵母幾丁質(zhì)合成酶的活性.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

釀酒酵母(S.cerevisiae)WHU2a由日本廣島大學(xué)宮川都吉教授惠贈；釀酒酵母CHT003和釀酒酵母CHT020由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

黃連(CoptischinensisFranch)購自杭州華東大藥房；兩性霉素B購自上海生工；尼克霉素Z，5-氟胞嘧，灰黃霉素，Calcofluor white均購自Sigma.

1.2 方 法

1.2.1 黃連醇提物的制備

黃連粉碎后，稱取80 g，加95%乙醇320 mL，浸泡48 h后用0.22 μm濾膜過濾，黃連醇提取液的濃度為250 mg/mL.

1.2.2 黃連醇提物對酵母在CFW抑制濃度下的生長挽救實(shí)驗(yàn)

制備含6 μg/mL CFW的YPD平板備用.挑取活化2 d的酵母WHU2a，接入5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/ min，培養(yǎng)16 h.稀釋菌懸液并與4 mL含CFW的上層YPD培養(yǎng)基混勻后倒入含6 μg/mL CFW的YPD平板制成雙層平板，使上層含有5×104個/mL酵母細(xì)胞和6 μg/mL CFW.將黃連乙醇提取物40 μL滴加在干燥無菌的Whatman 3MM濾紙片(直徑6 mm)上，待其乙醇揮發(fā)干燥后用無菌鑷子夾取帶藥的濾紙片水平放入皿內(nèi)上層培養(yǎng)基上，以乙醇40 μL滴加在濾紙片上待其揮發(fā)干燥后作為空白對照.另取尼可霉素6 μL(含量為30 μg)，滴加在干燥無菌的濾紙片上作為正對照；取兩性霉素B 6 μL(含量為6 μg)，滴加在干燥無菌的濾紙片上作為負(fù)對照.28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察藥物對酵母生長的挽救現(xiàn)象.

1.2.3 幾丁質(zhì)合成酶缺陷型酵母對黃連醇提物的敏感性實(shí)驗(yàn)

1) 黃連醇提物對酵母的抑菌作用的測定

分別挑取活化2 d的酵母WHU2a，CHT020，CHT003，接入5 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃，180 r/min，16 h.稀釋菌懸液并與4 mL上層YPD培養(yǎng)基混勻后倒入YPD平板制成雙層平板，使上層含有5×104個/mL酵母細(xì)胞.取黃連乙醇提取物40 μL，滴加在干燥無菌的濾紙片(直徑6 mm)上，待其乙醇揮發(fā)干燥后用無菌鑷子夾取帶藥的濾紙片水平放入皿內(nèi)雙層培養(yǎng)基上，以乙醇40 μL滴加濾紙片上待其揮發(fā)干燥后作為空白對照.以兩性霉素B5 μL(含量為5 μg)；5-氟胞嘧啶10 μL(含量為40 μg)；灰黃霉素10 μL(含量為100 μg)作為對照.28 ℃，培養(yǎng)48 h后用十字交叉法測量抑菌圈的直徑并觀察差異，即：抑菌圈直徑(mm)=抑菌透明圈直徑-6.

2) 黃連醇提物對酵母的最低抑制質(zhì)量濃度(MIC)的測定

MIC值的測定參照汪倩雯等的微量稀釋法[7]，并作某些修改.分別挑取活化2 d的酵母WHU2a，CHT020，CHT003單菌落至無菌水中，制成3×103CFU/mL的菌懸液，備用.在96孔板每列8孔中每孔加入100 μL用95%乙醇倍量稀釋的黃連醇提液，其質(zhì)量濃度從高到低依次為250.00，125.00，62.50，31.25，15.63，7.80，3.90，1.95 mg/mL，待其乙醇揮發(fā)干燥后，加100 μL的無菌水將黃連溶解.然后，再加100 μL的YPD培養(yǎng)基和100 μL的菌懸液(終質(zhì)量濃度為1×103CFU/mL).以100 μL的無菌水替代黃連溶液為陰性對照，以兩性霉素B替代黃連溶液為陽性對照(終質(zhì)量濃度依次為4，2，1，0.5，0.25 μg/mL).30 ℃，48 h培養(yǎng)后觀察菌體的生長情況，未見菌生長的最低藥物濃度即為藥物對酵母的最低抑菌濃度(MIC).每個菌株做三個平行實(shí)驗(yàn).

1.2.4 黃連醇提物對酵母細(xì)胞幾丁質(zhì)合成的影響

分別取對數(shù)生長期的WHU2a，CHT020和CHT003酵母細(xì)胞加入到100 mL含有黃連醇提物的YPD培養(yǎng)基，使初始細(xì)胞濃度為2×106個/mL，28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)20 h.其中，加入的黃連醇提物濃度隨菌株而異，對應(yīng)于WHU2a，CHT020和CHT003分別為1.56 mL，1 mL，0.9 mL，以乙醇代替黃連醇提物作為對照.將培養(yǎng)20 h的酵母細(xì)胞3 000 r/min離心5 min，棄上清，加蒸餾水50 mL震蕩20 s，待酵母細(xì)胞重新懸浮后再次離心.重復(fù)該步驟兩次以除去培養(yǎng)基雜質(zhì).收集酵母細(xì)胞，60 ℃烘箱中置放4 h，待其水分充分除去后，加入液氮，充分研磨以使細(xì)胞破碎.酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量的測定方法參考本研究室已發(fā)表的論文[8].

2 結(jié)果分析與討論

2.1 黃連醇提物能緩解CFW對酵母的抑制作用

熒光增白劑(CFW)能與酵母細(xì)胞壁中新合成的幾丁質(zhì)結(jié)合并抑制其生長，Roncero等研究發(fā)現(xiàn)尼克霉素(Nikkomycin Z，NiZ)等幾丁質(zhì)合成酶抑制劑均能使酵母在CFW抑制濃度下的生長得到挽救[9].本實(shí)驗(yàn)中，尼克霉素的周圍有明顯的酵母生長圈，表明尼克霉素具有明顯的挽救作用能夠解除CFW對酵母的抑制(圖1中C)，而空白對照以及負(fù)對照兩性霉素B均沒有挽救作用，有趣的是黃連醇提物對酵母生長也有挽救現(xiàn)象(圖1中B)，由此可以推斷黃連醇提物中存在幾丁質(zhì)合成酶抑制劑活性成分.

A—空白對照；B—黃連；C—尼克霉素；D—兩性霉素B

2.2 幾丁質(zhì)合成酶缺陷型酵母對黃連醇提物的敏感性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證黃連醇提物具有抑制真菌幾丁質(zhì)合成酶的活性，實(shí)驗(yàn)測定和比較了黃連醇提物對于野生型酵母WHU2a，以及2種不同幾丁質(zhì)合成酶缺陷型酵母CHT020和CHT003菌株的抑菌作用，結(jié)果見表1.

表1 黃連醇提物對三種酵母的抑菌圈

上述實(shí)驗(yàn)中，CHT003菌株是Chs1，Chs2基因敲除的酵母菌株，該酵母僅剩下一個Chs3基因，該菌株對幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ(CS3)的特異性抑制劑敏感性增加；而CHT020菌株是Chs1，Chs3基因敲除的酵母菌株，該酵母僅剩下一個Chs2基因，該菌株對幾丁質(zhì)合成酶Ⅱ(CS2)的特異性抑制劑敏感性增加[10-11].與野生型菌株WHU2a比較,黃連醇提物對于CHT003有明顯的抑制作用，CHT003的抑菌圈比WHU2a的抑菌圈大二倍以上；而CHT020的抑菌圈僅比WHU2a的抑菌圈略微大一些.實(shí)驗(yàn)同時比較了兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、灰黃霉素等具有不同作用機(jī)制的常用抗真菌劑對上述三種酵母的抑制作用，結(jié)果均無明顯的特異性抑制作用，表明這些抗真菌劑的作用靶標(biāo)不是幾丁質(zhì)合成酶.在本實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，灰黃霉素對三種酵母均無抑菌作用.實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步測定了黃連醇提物對于WHU2a，CHT020，CHT003的MIC值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 黃連醇提物對三種酵母的MIC值

從表2中可以看出:幾丁質(zhì)合成酶缺陷型酵母(CHT003和CHT020)對黃連醇提物更加敏感，尤其CHT003的敏感性是野生酵母的4倍.表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅與正篩選結(jié)果(圖1)一致，而且進(jìn)一步揭示了黃連醇提物中明顯存在幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ(CS3)的特異性抑制活性成分.由于在酵母細(xì)胞中90%的幾丁質(zhì)是由幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ(CS3)合成的，可以預(yù)期黃連醇提物處理后酵母細(xì)胞幾丁質(zhì)含量會明顯下降.

2.3 黃連醇提物處理后酵母細(xì)胞幾丁質(zhì)含量的變化

由于幾丁質(zhì)是由β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖殘基呈線形連接而成的生物大分子聚合物，因此，可通過測酵母細(xì)胞中N-乙酰-D-葡糖胺的量來確定細(xì)胞中的幾丁質(zhì)含量[8].實(shí)驗(yàn)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為x=(y-0.011 5)/0.004 5，酵母細(xì)胞中幾丁質(zhì)含量是三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值如圖2所示.

圖2 酵母細(xì)胞中的幾丁質(zhì)含量

對未加黃連的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，菌株CHT003的幾丁質(zhì)含量達(dá)到17 μg/mg，比野生型WHU2a還高20%.Garcia-Rodriguez等發(fā)現(xiàn)敲除釀酒酵母中葡聚糖合成酶基因fks1后會引起CS3活性大幅提高[16].Lesage等也報(bào)道了釀酒酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合成中的互補(bǔ)現(xiàn)象，多數(shù)參與細(xì)胞壁合成的基因被敲除后都會引起CS3活性和幾丁質(zhì)含量的明顯提高[17].CS3負(fù)責(zé)酵母中90%以上幾丁質(zhì)的合成.由此可以解釋CHT003的幾丁質(zhì)含量比野生型更高是因?yàn)镃hs1和Chs2基因敲除促進(jìn)了Chs3基因表達(dá)的結(jié)果.加黃連后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們的預(yù)期相符，黃連醇提物處理后的釀酒酵母WHU2a細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量降低了28%，CHT003細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量降低22.6%，而黃連醇提物處理后的釀酒酵母CHT020幾丁質(zhì)含量降低較少.這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了中藥黃連醇提取物中含有抑制酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ的活性物質(zhì).

2.4 討 論

黃連是一種傳統(tǒng)的中藥，具有很高的藥用價值.對其藥理作用也有不少研究.Kobayashi等從黃連根莖中分離出2個原小檗堿生物堿(表小檗堿和groenlandicine)，研究發(fā)現(xiàn)分別是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ的抑制劑，對細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組等起重要作用[12].Hirano等從黃連中分離到落葉松脂素和反式阿魏酸對羥基苯乙酯，研究表明：二者為自由基清除劑，均顯示SOD樣作用，落葉松脂素作為超氧化物自由基清除劑比抗壞血酸更為有效[13].Kong等發(fā)現(xiàn)黃連中的小檗堿有降低膽固醇作用[6].黃連也具有抗真菌作用，但是其作用機(jī)理還不清楚[14].

Park等曾報(bào)道過黃連中的巴馬亭在體外會抑制假絲酵母的幾丁質(zhì)合成酶活性，但沒有提到是哪一種幾丁質(zhì)合成酶[15].本研究用釀酒酵母作為模型，通過檢測98種常用中草藥的醇提物對酵母在CFW抑制濃度下的生長挽救現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)黃連醇提物對酵母幾丁質(zhì)合成酶有抑制作用.釀酒酵母有3個幾丁質(zhì)合成酶結(jié)構(gòu)基因Chs1，Chs2和Chs3，其中Chs2和Chs3具有重要的生物學(xué)功能[10].Chs2與有絲分裂末期的母細(xì)胞和子細(xì)胞之間合成初級隔膜有關(guān)；Chs3與細(xì)胞出芽位點(diǎn)處合成幾丁質(zhì)環(huán)有關(guān)，并與正常細(xì)胞中90%的幾丁質(zhì)合成有關(guān).Chs1及Chs2基因敲除后的幾丁質(zhì)合成酶缺陷型酵母CHT003，以及Chs1及Chs3基因敲除后的幾丁質(zhì)合成酶缺陷型酵母CHT020都能正常生長；但CHT003對幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ的抑制劑高度敏感而CHT020對幾丁質(zhì)合成酶Ⅱ的抑制劑高度敏感[11].本實(shí)驗(yàn)觀測到黃連醇提物對野生型酵母，CHT020以及CHT003的MIC值分別為2 600，1 300，650 mg/L，表明黃連醇提物中主要含有抑制幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ的活性成分；幾丁質(zhì)含量測定實(shí)驗(yàn)揭示，黃連醇提物處理后野生型酵母和CHT003幾丁質(zhì)含量均大幅降低，而CHT020幾丁質(zhì)含量降低較少，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果.黃連醇提物中具有抑制真菌幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ的活性成分，可以作為特異性抑制真菌藥物值得進(jìn)一步研究.

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以酵母細(xì)胞為模型，研究了黃連醇提液對真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合酶的抑制作用，通過檢測黃連醇提液對酵母在熒光增白劑(Calcofluor white，CFW)抑制濃度下的生長挽救現(xiàn)象，比較黃連醇提液對野生型和幾丁質(zhì)合酶缺陷型酵母菌株抑制作用的差異，以及測定黃連醇提物處理后酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量的變化，結(jié)果顯示黃連醇提液能挽救酵母在CFW抑制濃度下的生長，幾丁質(zhì)合酶缺陷型菌株CHT003對黃連醇提液的敏感性比野生型大4倍，黃連醇提液處理后野生型酵母和缺陷型菌株CHT003的幾丁質(zhì)含量明顯降低.說明黃連醇提物具有明顯的抑制酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合酶Ⅲ的活性成分.

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