豚鼠樹突狀細胞的誘導(dǎo)與特性分析

劉 升

(中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

1973年Steinman[1]首次分離出樹突狀細胞。樹突狀細胞是目前已知功能最強的專職性抗原提呈細胞，其激活T淋巴細胞的能力較巨噬細胞、B淋巴細胞強100 ～ 1 000倍以上，并且是唯一能激活初始免疫應(yīng)答的抗原提呈細胞[2-4]。正如我國曹雪濤院士所闡述的，樹突狀細胞是人體內(nèi)數(shù)量極少且功能最強的抗原提呈細胞，是人體建立完善免疫學(xué)“防御機制”的基礎(chǔ)。隨著人們對樹突狀細胞的生物學(xué)特性及功能的了解不斷加深并在某些疾病的基礎(chǔ)研究和臨床防控應(yīng)用中取得了令人鼓舞的成果，樹突狀細胞的重要性也越來越受到人們的重視。

由于樹突狀細胞在外周血中含量極少，僅占單核細胞總數(shù)的0.1%～10%，分離純化困難，故臨床應(yīng)用受到極大限制，因此成熟的樹突狀細胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立是獲得足夠數(shù)量的具有功能作用的樹突狀細胞的另一重要有效途徑。近年來，在體外采用了多種不同的分化途徑誘導(dǎo)擴增樹突狀細胞的研究，包括用人臍血[5]、骨髓[6]和粒細胞集落刺激因子動員后外周血中的造血干/祖細胞或單核細胞體外誘導(dǎo)擴增[7]，并已獲得成功。用于培養(yǎng)樹突狀細胞的細胞因子有很多，其中主要有粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素4、干擾素α、Flt3配體和白細胞介素13等[8]，在相差顯微鏡及電鏡下觀察，所培養(yǎng)的細胞均具有典型的樹突狀細胞形態(tài)特征，均明顯有別于單核細胞和巨噬細胞[9]。

樹突狀細胞在體內(nèi)分布廣泛，但數(shù)量較少，因此如何獲得大量的樹突狀細胞就成為進一步研究樹突狀細胞特性和功能的前提。豚鼠由于其在生理學(xué)與免疫應(yīng)答等方面與人類有極高的相似性，并且關(guān)于豚鼠樹突狀細胞相關(guān)的研究報導(dǎo)很少，因此，我們的實驗在體外培養(yǎng)擴增了豚鼠骨髓樹突狀細胞，為優(yōu)化樹突狀細胞的體外培養(yǎng)和建立能獲得大量具有抗原提呈功能的樹突狀細胞的方法體系提供實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

豚鼠購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑

重組粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素4(IL-4)(美國Tepro-tech公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液、紅細胞裂解液、體積分數(shù)為75% 乙醇(實驗室自配)；胎牛血清(美國 Hyclone公司)、青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液、結(jié)核分枝桿菌弱毒卡介苗(BCG)(實驗室保存)；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒(上海薩博生物有限公司)。

1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺(江蘇凈化儀器制造廠)；CO2細胞培養(yǎng)箱(上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司)；離心機、倒置熒光顯微鏡(日本OLMPUS，IX71)；流式細胞儀 、電子天平(德國 METTLER)。

2 實驗方法

2.1 豚鼠骨髓來源樹突狀細胞的培養(yǎng)[3-5]

2.1.1 豚鼠骨髓細胞的制備 將豚鼠脫頸處死,無菌操作取出股骨、脛骨及肱骨,盡量將肌肉和結(jié)締組織去除。切除取出的骨的兩端,在含有青、鏈霉素雙抗的PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，用5 mL無菌注射器反復(fù)沖洗骨髓。將沖洗液收入15 mL離心管中，以1∶5 的體積比加入37 ℃預(yù)溫的紅細胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，置室溫5 min，離心， 1 000 r/min，5 min，棄上清液除去紅細胞，再經(jīng)細胞培養(yǎng)液洗滌1次，離心收集沉淀的骨髓細胞[10]。

2.1.2 樹突狀細胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng) 將骨髓細胞重懸于細胞培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，每皿加10 mL體積分數(shù)為10%胎牛血清及雙抗(含青霉素100 U/mL,鏈霉素100 mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液。將細胞輕輕搖勻置于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后，吸取未貼壁的懸浮細胞，再用培養(yǎng)液輕輕沖洗以去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的單核細胞[11-12]。

將細胞分為細胞因子誘導(dǎo)組和對照組。誘導(dǎo)組細胞培養(yǎng)液中添加誘導(dǎo)因子GM-CSF、IL-4(濃度分別為20 μg/L和10 μg/L),每2 d換液1次。

2.2 樹突狀細胞的表型鑒定與特性分析

2.2.1 倒置顯微鏡觀察 在倒置顯微鏡下觀察樹突狀細胞形態(tài)及數(shù)量的變化，并拍照。

2.2.2 免疫熒光細胞化學(xué) 培養(yǎng)的細胞用PBS洗3次，用40 g/L 的多聚甲醛室溫固定30 min，固定的細胞用PBST(含有體積分數(shù)為0.2%的Triton X-100)洗滌3次后，用PBST在室溫下透膜10 min，洗滌后細胞置于含體積分數(shù)為10%山羊血清和 50 g/L脫脂奶粉的PBST中，室溫下封閉30 min。然后置于用含20 g/L脫脂奶粉、體積分數(shù)為10 %山羊血清的PBST稀釋后的CD14一抗中，4 ℃冰箱過夜。用PBST洗滌3次，室溫下置于用含20 g/L脫脂奶粉、體積分數(shù)為10% 山羊血清的PBST稀釋后的二抗中，孵育1 h[鼠抗CD14，1∶100，二抗為熒光標(biāo)記的goat anti-mouse IgG+IgA+IgM( H+L )FITC conjugate][12-13]。熒光顯微鏡下拍照。

2.2.3 BCG誘導(dǎo)樹突狀細胞凋亡分析 取12 孔細胞培養(yǎng)板，分別接種濃度為5.0×105/mL的樹突狀細胞1 mL，置37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。小心吸棄培養(yǎng)液，按細菌∶細胞=100∶1的比例，每孔加入濃度為5.2×107CFU/mL 的BCG懸液 1 mL，37 ℃ 孵育24 h， PBS 洗3次，然后分別用 Annexin V-FITC 和 Propidiumiodide( PI) 染色，按 Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒操作說明書，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。未用BCG刺激培養(yǎng)的樹突狀細胞為對照組[14-15]。

3 結(jié)果

3.1 體外培養(yǎng)樹突狀細胞倒置顯微鏡觀察結(jié)果

由豚鼠骨髓直接分離的樹突狀細胞量很少,經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3 d后樹突狀細胞量逐漸增多, 2周后細胞計數(shù)擴增至70%～80%。

在倒置顯微鏡下可見，培養(yǎng)1 d的細胞貼壁生長, 有細胞聚集現(xiàn)象, 呈均勻分布的細胞集落，細胞體積小,形狀不規(guī)則,邊緣可見細小偽足,無樹枝樣突起。培養(yǎng)3 d后,細胞成簇生長,大多數(shù)細胞仍然貼壁,少數(shù)細胞處于半懸浮狀態(tài),細胞體積與以前接近,細胞核呈圓形或橢圓形，較小,細胞周邊可見毛刺狀突起,但毛刺較短,分枝較少。培養(yǎng) 5 d后,較多細胞呈半懸浮生長,可見大部分細胞呈梭形及不規(guī)則形狀，細胞體積較以前增大,分別聚集生長,周邊可見明顯的刺狀突起,突起較長,可見分枝。培養(yǎng)7 d后,細胞體積較前增大,周邊刺突十分明顯,突起較粗大,分枝較明顯,細胞形態(tài)似星形或梭形,細胞核明顯,細胞聚集生長。培養(yǎng)10 d后,細胞生長旺盛,細胞體積增大,具有明顯樹枝狀突起,突起粗大且較長,胞體相對飽滿,細胞形態(tài)呈星形、多邊形或梭形。培養(yǎng)14 d后,大多數(shù)細胞出現(xiàn)懸浮生長,呈現(xiàn)典型的樹突狀細胞形態(tài), 細胞呈星形或梭形,形似“海星”細胞核清晰可見,細胞表面突起增多,細長,分支較多,呈蔓狀分布于細胞表面,形似樹枝狀。見圖1、圖2、圖3。

3.2 化學(xué)免疫檢測

經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的豚鼠樹突狀細胞，經(jīng)免疫熒光細胞化學(xué)檢測，細胞呈CD14陽性。見圖4。

3.3 BCG誘導(dǎo)樹突狀細胞凋亡分析

流式細胞儀結(jié)合Annexin V-FITC 標(biāo)記法檢測發(fā)現(xiàn)，BCG與樹突狀細胞混合培養(yǎng)24 h后，細胞凋亡率為18.95%，顯著高于對照組4.3%。見圖5。

圖1 培養(yǎng)3 d后的細胞

圖2 培養(yǎng)5 d后的細胞

圖3 培養(yǎng)10 d后的細胞

a：相差顯微鏡；b：熒光顯微鏡。

a：BCG與樹突狀細胞混合培養(yǎng)24 h組；b：對照組。

4 分析與討論

我們的實驗對培養(yǎng)的豚鼠樹突狀細胞形態(tài)學(xué)和免疫表型進行了鑒定，保證了培養(yǎng)體系的正確。形態(tài)學(xué)方面,骨髓中單核細胞在培養(yǎng)3 d以后,部分細胞出現(xiàn)不規(guī)則的樹突樣突起,與相關(guān)文獻[13]報道一致。樹突狀細胞成熟與否與其表面標(biāo)記分子表達程度的高低有關(guān)。在樹突狀細胞的表型鑒定方面,豚鼠的表面標(biāo)記物中較為常用的為MHC2II類表面黏附分子CD14，可作為豚鼠DC表面的特異性標(biāo)記物[14]。實驗將豚鼠的特異性標(biāo)記CD14作為鑒定的指標(biāo),其表達符合樹突狀的成熟狀態(tài)。誘導(dǎo)宿主細胞凋亡是許多病原微生物重要的致病機制[15-16]。實驗中BCG與樹突狀細胞混合培養(yǎng)24 h后，細胞凋亡率為18.95%，顯著高于對照組4.30%，從而提示BCG在與樹突狀細胞混合培養(yǎng)中可誘導(dǎo)樹突狀細胞發(fā)生凋亡。據(jù)此推測，這種BCG誘導(dǎo)樹突狀細胞的凋亡作用，可能對有效地控制結(jié)核分枝桿菌在胞內(nèi)的生存、繁殖和擴散有著重要的意義。

我們的實驗所采用的樹突狀細胞體外原代培養(yǎng)的方法，成功建立了體外獲得大量成熟樹突狀細胞的方法體系，為進一步研究樹突狀細胞的特性和功能提供實驗材料，而且培養(yǎng)的樹突狀細胞具有一定的純度和保持體內(nèi)樹突狀細胞所具有的生物學(xué)特征。這不僅為樹突狀細胞的體外培養(yǎng)提供了有效的研究方法，而且也為在細胞水平研究樹突狀細胞的表型、功能及免疫治療等提供可靠的體外實驗材料。

(從課題的選擇到實驗的過程再到論文的撰寫，均在吳月紅教授的悉心指導(dǎo)下完成。在此，對我的導(dǎo)師吳月紅教授致以誠摯的謝意。)

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