艱難梭菌臨床分離株5年前后耐藥性變化

周芬芬，吳 湜，徐少華，黃海輝

艱難梭菌（Clostridium difficile）是醫(yī)院獲得感染性腹瀉最主要的病原菌，在抗生素相關(guān)性腹瀉中占20%～30%，而假膜性腸炎則幾乎90%以上均由艱難梭菌所致，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）。自2002年起北美和歐洲相繼發(fā)生100多次CDI暴發(fā)流行，主要與高產(chǎn)毒株核糖體型027有關(guān)［1］。當(dāng)前北美仍以核糖體型027為最多見(jiàn)；歐洲2008年之后其他核糖體型如014／020、078等逐漸成為主要流行株［2］。國(guó)內(nèi)近年來(lái)對(duì)CDI亦越來(lái)越重視，Huang等［3］和陳云波等［4］報(bào)道CDI占醫(yī)院感染性腹瀉的9.5%～30.7%，但我國(guó)迄今為止尚未有核糖體型027感染的報(bào)道。

抗菌藥物的應(yīng)用是CDI的最主要危險(xiǎn)因素。艱難梭菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥，在核糖體型027等高毒株的廣泛傳播中亦具重要作用［1］。Oka等［5］和Ilchmann等［6］報(bào)道艱難梭菌對(duì)克林霉素和紅霉素的耐藥率超過(guò)80%，對(duì)莫西沙星的耐藥率高達(dá)56%。國(guó)內(nèi)流行株核糖體型017對(duì)紅霉素、莫西沙星、克林霉素等抗菌藥物的耐藥率亦超過(guò)50%［7］。甲硝唑和萬(wàn)古霉素迄今仍為治療CDI的一線藥物［8］，但近期亦有報(bào)道艱難梭菌對(duì)這2種藥物的敏感性有所下降［9］。本課題對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院5年前后的艱難梭菌臨床分離株耐藥性和核糖體分型的變化進(jìn)行了研究，為制定CDI的防治策略提供參考。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來(lái)源 收集2007年8月—2008年7月和2012年8月—2013年7月我院醫(yī)院獲得性腹瀉患者糞便中分別分離到的74株與64株艱難梭菌，經(jīng)革蘭染色及PCR擴(kuò)增gluD基因陽(yáng)性鑒定。剔除重復(fù)菌株。

（二）培養(yǎng)基及抗菌藥物 CCFA（頭孢甲氧噻吩－環(huán)絲氨酸－果糖－瓊脂）選擇培養(yǎng)基為英國(guó)OXIOD公司產(chǎn)品；Brucella瓊脂培養(yǎng)基為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；抗菌藥物包括甲硝唑、萬(wàn)古霉素、紅霉素、莫西沙星、夫西地酸、左氧氟沙星、克林霉素、四環(huán)素、利福平和亞胺培南為美國(guó)Sigma－aldrich公司產(chǎn)品。

（三）主要儀器及試劑 細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)試劑盒為美國(guó)Techlab公司產(chǎn)品；Concept 400厭氧工作站為英國(guó)Ruskinn公司產(chǎn)品，多重實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction ，PCR）儀 為 美 國(guó)Cepheid公司產(chǎn)品；HotStarTaq Master Mix試劑盒為德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品。

二、方法

（一）毒素檢測(cè) 采用普通PCR檢測(cè)tcdA基因，多重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)tcdB、cdtA、cdtB基因。另以細(xì)胞毒中和試驗(yàn)對(duì)毒素B加以確證。

（二）核糖體分型和多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 采用 PCR 核糖體分型法［10］對(duì)所有分離到的產(chǎn)毒株進(jìn)行分型。PCR核糖分型圖譜參照英國(guó)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室厭氧菌參考實(shí)驗(yàn)室 ［Public Health Laboratory Services （PHLS）Anaerobic Reference Unit，Cardiff］標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜（部分）。如圖譜與標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜一致，則按標(biāo)準(zhǔn)株核糖體型命名，例如核糖體型027；反之則以英文字母如 A、B、C、等順序分型［7］。部分菌株采用Stabler等［11］推薦的方法測(cè)定 MLST，以7個(gè)管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi）作 為 目 標(biāo)測(cè)序基因，在www.mlst.net網(wǎng)站上進(jìn)行分析，得出序列型。

（三）抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 按CLSI推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定10種抗菌藥物對(duì)艱難梭菌的MIC。藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基采用Brucella瓊脂添加5 mg／L血紅素，1 mg／L維生素K以及5%脫纖維羊血。按CLSI 2011年版M11－A8推薦艱難梭菌瓊脂稀釋法接種菌液為107CFU／mL，接種菌量為104CFU／點(diǎn)［12］。37℃厭氧培養(yǎng)48 h。按 CLSI 2007年版M11－A7以及2013年版M100－S23標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏試驗(yàn)結(jié)果。CLSI無(wú)確切判斷標(biāo)準(zhǔn)藥物的耐藥折點(diǎn)，按文獻(xiàn)［13－14］報(bào)道：萬(wàn)古霉素≥32 mg／L；紅霉素≥8 mg／L；利福平≥4 mg／L；左氧氟沙星≥8 mg／L；夫西地酸＞0.5 mg／L。質(zhì)控菌株為艱難梭菌ATCC700057和脆弱擬桿菌ATCC 25285。對(duì)3類以上不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗菌藥物耐藥的菌株為多重耐藥株。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件計(jì)算 MIC50和 MIC90。

結(jié) 果

一、毒素與核糖體分型

2007年8月—2008年7月與2012年8月—2013年7月分別獲得74株與64株艱難梭菌產(chǎn)毒株。5年前分離到的74株菌中，23株僅產(chǎn)B毒素（A－B＋，31.1%），49株產(chǎn) A、B兩種毒素（A＋B＋，66.2%），2株同時(shí)產(chǎn)A、B兩種毒素和二元毒素（A＋B＋CDT＋，2.7%）。74株菌分別屬于18個(gè)核糖體型，以核糖體型017（A－B＋，24.3%）最為常見(jiàn)。5年后的64株臨床分離株中，22株為A－B＋，占34.4%；42株為A＋B＋，占65.6%。共檢測(cè)到18個(gè)核糖體型，以核糖體型 H（A－B＋，18.8%）最為常見(jiàn)，其次為核糖體型017和012，見(jiàn)表1。H型菌株MLST結(jié)果為ST－81型。

二、藥敏試驗(yàn)分析

138株艱難梭菌對(duì)抗菌藥物的敏感性見(jiàn)表2。所有菌株對(duì)甲硝唑和萬(wàn)古霉素均呈高度敏感。2012—2013年臨床分離株中，分別有26.6%、67.2%、65.6%和28.1%的菌株對(duì)莫西沙星（MIC≥32 mg／L）、紅霉素（MIC＞128 mg／L）、克林霉素（MIC＞128 mg／L）和四環(huán)素（MIC≥32 mg／L）呈高度耐藥；32.8%（21／64）的菌株同時(shí)對(duì)紅霉素、克林霉素、莫西沙星和四環(huán)素呈多重耐藥，其中81.0%（17／21）的多重耐藥菌株屬于核糖體 H型（12／21）和017型（5／21）。與5年前相比，艱難梭菌臨床分離株對(duì)克林霉素耐藥率由74.3%升至84.4%、對(duì)四環(huán)素由39.2%升至48.4%、對(duì)夫西地酸由25.7%升至35.9%，耐藥率呈升高趨勢(shì)，并出現(xiàn)了亞胺培南耐藥株；但對(duì)左氧氟沙星和利福平的耐藥率則出現(xiàn)下降趨勢(shì)，分別由78.4%和20.3%降至47.4和7.8%。同時(shí)5年后多重耐藥株（32.8%）的比率亦高于5年前（28.3%）。

表1 艱難梭菌臨床分離株5年前后的毒素類別及核糖體分型Table 1 Ribotypes and toxin profiles of clinical Clostridium difficile isolates during two periods with an interval of 5 years

表2 比較10種抗菌藥物對(duì)艱難梭菌5年前后臨床分離株的最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentrations（MICs）of 10 antimicrobial agents against the Clostridium difficile isolates during two periods with an interval of 5 years

討 論

雖然A＋B＋菌株在艱難梭菌感染中仍占主導(dǎo)地位，但是A－B＋菌株感染的報(bào)道亦非少見(jiàn)。歐洲和美國(guó)艱難梭菌臨床分離株仍以A＋B＋菌株為主，A－B＋菌株總分離率為1%～3%［2，15］；但日本和韓國(guó)的艱難梭菌A－B＋產(chǎn)毒株臨床分離率則上升至12.7%～21.4%［16－17］，我 國(guó)陳云 波等［4］和章黎華等［18］報(bào)道A－B＋產(chǎn)毒株占所有分離產(chǎn)毒株的34.0%～37.5%。亞洲國(guó)家A－B＋菌株的分離率明顯高于歐美國(guó)家，有可能與核糖體型017（A－B＋）菌株在亞洲國(guó)家的流行有關(guān)［2，7，15］。本研究中臨床分離株雖然總體來(lái)說(shuō)以A＋B＋菌株為多見(jiàn)，但A－B＋菌株亦約占30%，與陳云波等［4］報(bào)道相仿。因此在國(guó)內(nèi)醫(yī)院的檢驗(yàn)科若僅檢測(cè)A毒素將有約1／3 CDI患者可能漏診。

盡管核糖體型027菌株過(guò)去數(shù)年中在北美與歐洲廣泛流行，但是亞洲的相關(guān)報(bào)道仍比較少，僅韓國(guó)、新加坡、日本與我國(guó)香港有零星報(bào)道。另一新流行株核糖體型078，在荷蘭2005—2008年其分離率從3%迅速增長(zhǎng)到13%，但本研究并未檢測(cè)到。我院2007年8月—2008年7月艱難梭菌臨床分離株以核糖體型017為主，5年后則以H型最多見(jiàn)，占18.8%。H型菌株MLST分型為ST－81型，與核糖體017型／ST－37具有較高的同源性［11］，且兩者的毒素類別均為A－B＋。2012年上海中山醫(yī)院曾在腹瀉伴血流感染患者的糞便和血液中均分離到艱難梭菌，經(jīng)檢測(cè)這2株菌核糖體分型同為H型，提示該型菌株不僅導(dǎo)致腹瀉，而且能引起更為嚴(yán)重且罕見(jiàn)的血流感染。

甲硝唑和萬(wàn)古霉素體外對(duì)艱難梭菌具有良好抗菌活性，耐藥株罕見(jiàn)。然而2008年P(guān)eláez等［19］報(bào)道西班牙一所醫(yī)院艱難梭菌臨床分離株中12%菌株對(duì)甲硝唑呈異質(zhì)性耐藥，本課題組在前期也有類似報(bào)道［20］。但2012—2013年并未在分離到的新鮮菌株中檢測(cè)到異質(zhì)性耐藥菌。與5年前相比，當(dāng)前艱難梭菌臨床分離株對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率有所增高，其中對(duì)克林霉素、四環(huán)素、夫西地酸的耐藥率約增高10個(gè)百分點(diǎn)，且對(duì)紅霉素、克林霉素、莫西沙星和四環(huán)素耐藥的多重耐藥菌的比率亦上升至32.8%。耐藥率的升高原因之一可能與近2年核糖體型017和 H型在醫(yī)院內(nèi)的流行相關(guān)（20／64，31.3%），因這2種類型的細(xì)菌多呈多重耐藥；其次可能與抗生素選擇性壓力有關(guān)［21－22］，例如2007年我院多西環(huán)素和亞胺培南－西司他丁的用量分別為200DDDs和2 205.5DDDs，至2012年分別上升至2 896DDDs和3 675.8DDDs。

近10年來(lái)，艱難梭菌作為一種條件致病菌在感染性疾病中的重要性日漸增加。應(yīng)重視CDI的檢測(cè)，建議對(duì)急性醫(yī)院獲得性腹瀉患者，特別是近3個(gè)月內(nèi)曾經(jīng)接受過(guò)抗菌藥物治療者送檢糞便標(biāo)本，一旦確診應(yīng)立即隔離診治，并合理應(yīng)用抗菌藥物，嚴(yán)格掌握適應(yīng)證，避免盲目使用廣譜抗菌藥物對(duì)于降低艱難梭菌感染的發(fā)病和傳播亦極為重要。

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