產(chǎn)纖維素酶低溫菌株的分離鑒定

桓明輝等

摘要：為促進秸稈還田，加快秸稈在北方設(shè)施土壤中的降解速度，以腐爛秸稈為待篩菌株原料，以玉米秸稈粉為培養(yǎng)基，在15℃低溫條件下，采用剛果紅平板法進行初篩，得到16株菌株，對16株菌株進行酶活測定復(fù)篩，其中L-13酶活最高，達1 679.61 U/ml。對L-13菌株的菌體形態(tài)、菌落特征進行觀察，并進行了一系列生理生化試驗和16S rDNA 序列分析，初步鑒定L-13為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。此菌可以在15℃下快速生長繁殖并高產(chǎn)纖維素酶，低溫條件下能快速降解秸稈。

關(guān)鍵詞：玉米秸稈；低溫；纖維素酶

中圖分類號：Q93-331 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2014）03-0054-04

AbstractIn order to promote straw returning and speed up its degradation in the North greenhouse soil， using rotten straw as raw materials and corn straw powder as medium， 16 strains were isolated with Congo Red plate method at 15℃. Then the enzyme activities of 16 strains were detected. L-13 had the highest enzyme activity of 1 679.61 U/ml. The mycelial morphology and colony characteristics of L-13 were observed， and a series of physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis were conducted. The L-13 strain was preliminarily identified as Bacillus subtilis.Owing to growing fastly and high yielding of cellulase at 15℃，it could degrade the straw under low temperature rapidly.

Key wordsCorn straw； Low temperature； Cellulase

我國的玉米秸稈資源分布較廣，是一種易得的可再生生物資源。目前秸稈的主要用途是秸稈還田和制備粗飼料，但用量總和不足秸稈總量的40%，其余則被焚燒掉，造成了極大的資源浪費和環(huán)境污染。為了進一步提高秸稈的利用率，加快秸稈的降解速度，尤其是低溫條件下的降解效率，以滿足北方冬季設(shè)施秸稈還田的需要，本試驗在低溫（15℃）環(huán)境下，篩選出了玉米秸稈低溫快速腐熟菌，并進行了菌株鑒定，以期為北方冬季設(shè)施秸稈還田提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料玉米秸稈，采自朝陽市郊區(qū)，粉碎后用于腐熟菌的篩選。

1.1.2試劑0.05 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液；3，5-二硝基水楊酸顯色液（DNS）；0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；0.2 mg/ml纖維素酶；2 mol/L鹽酸溶液。

1.1.3培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基：玉米秸稈粉20 g，瓊脂20 g，水1 000 ml，121℃滅菌30 min，備用。篩選培養(yǎng)基：剛果紅纖維素鈉培養(yǎng)基，見《微生物學(xué)實驗》。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 ml，pH 7.0～7.2，121℃滅菌30 min，備用。生理生化鑒定培養(yǎng)基及試劑見《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》。

1.1.4儀器設(shè)備高速冷凍離心機、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、PCR儀、電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、731型分光光度計等。

1.2試驗方法

1.2.1低溫降解纖維素菌株的分離將腐爛的玉米秸稈（含待篩菌株）粉碎，取0.5 g加入49.5 ml無菌水，置于振蕩器上振蕩30 min，后吸取1 ml加入9 ml無菌水，以此類推，共稀釋到10-9。

吸取0.1 ml不同倍數(shù)稀釋液于篩選培養(yǎng)基上，涂平板，15℃低溫條件下培養(yǎng)，直到形成單菌落。

1.2.2低溫降解纖維素菌株初篩將所得單菌落分別挑到剛果紅纖維素鈉平板中，每個平皿一種菌株，重復(fù)3次，15℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)48 h。觀察平板，標(biāo)記有水解圈的菌株、測量水解圈直徑并記錄試驗結(jié)果。

1.2.3低溫降解纖維素菌株復(fù)篩原樣酶液制備：將初篩所得菌株分別轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，15℃培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液 1 ml于EP管中，10 000 r/min離心10 min，上清液即為原樣酶液。

DNS法測酶活力：取3支容量為20.0 ml的試管，一支做空白對照，其余2支做平行樣品管。取1.0 ml原樣酶液加入樣品管中，后向3支試管中分別加入4.0 ml預(yù)熱至60℃的底物溶液，60℃水浴準(zhǔn)確計時20 min取出，立即加入1.0 ml 2.0 mol/L的氫氧化鈉溶液和2.0 ml DNS顯色液，搖勻，在對照管中再加入1.0 ml原樣酶液，后將3支試管置于沸水浴準(zhǔn)確計時顯色5 min取出，流水迅速冷卻，并用蒸餾水定容至20.0 ml，搖勻后用分光光度計測定490 nm處吸光度值。定義每分鐘產(chǎn)生1 μg葡萄糖為一個酶活單位。

纖維素酶活計算：U=M1-M0/20

式中，U為樣品的酶活力，單位為微克每分鐘（μg/min）；M0為對照葡萄糖量，單位為微克（μg）；M1為分解后樣品質(zhì)量，單位為微克（μg）；20為酶與底物反應(yīng)時間，單位為分鐘（min）。

1.3菌種鑒定

1.3.1菌株形態(tài)和生理生化鑒定根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色性狀、芽孢染色性狀及有關(guān)生理生化鑒別試驗，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進行屬和種的鑒定。

菌株形態(tài)鑒定：將復(fù)篩得到L-13菌株進行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5稀釋液于分離培養(yǎng)基上涂平板，15℃培養(yǎng)48 h得單菌落，觀察記錄菌落形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。另挑取15℃培養(yǎng)24 h的菌株，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，并進行芽孢、鞭毛染色。

生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗。主要進行H2S 產(chǎn)生試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、過氧化氫酶（接觸酶）試驗、精氨基脫羧酶試驗、淀粉水解、V.P（乙酰甲基甲醇）試驗、M.R（甲基紅）試驗、檸檬酸鹽試驗、酪素水解、糖、醇發(fā)酵試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、纖維素水解試驗、脲酶（尿素水解）試驗、丙二酸鹽試驗、硝酸鹽還原試驗和3-酮基乳糖試驗。

1.3.216S rDNA鑒定DNA提取和16S rDNA擴增：參考Kim等和Rainey等方法提取細(xì)菌總DNA。1%瓊脂糖電泳檢測。引物為通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。 PCR 反應(yīng)體系：DNA模板（70 ng/μl）2 μl；dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.5 μl；27F（20 μmol/L）1.5 μl；1495 R（20 μmol/L）1.5 μl；10×Ex Taq Buffer（Mg2+ pluse）5 μl；Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μl；補足ddH2O到50 μl。PCR條件：94℃預(yù)變性3 min； 94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將測得的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行相似性分析，將所得相近序列利用 Clustal X（1.8）進行多重序列比對（Multiple alignments），并用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1低溫降解纖維素菌株的篩選

2.1.1低溫降解纖維素菌株的初篩經(jīng)初篩得到產(chǎn)纖維素酶的菌株16株，分別命名為L-1～L-16（表1），水解圈直徑為15.2～35.3 mm，其中L-13水解圈直徑最大，為35.3 mm。

3結(jié)論

利用剛果紅纖維素鈉初篩、纖維素酶活復(fù)篩，從腐熟秸稈粉中篩選出一株低溫條件下能夠快速降解玉米秸稈的菌株L-13，根據(jù)其形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。北方冬季（12～2月）設(shè)施地溫低，多在12～20℃之間，低溫條件下能夠快速生長并高產(chǎn)纖維素酶的L-13菌種有一定的應(yīng)用前景。

參考文獻：

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頓寶慶，吳薇，王旭靜，等.一株高纖維素酶活力纖維素分解菌的分離與鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2008，10（1）：113-117.

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[3]韓學(xué)易，陳惠，吳琦，等.產(chǎn)纖維素酶枯草芽孢桿菌 C-36 的產(chǎn)酶條件研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，24（2）：179-181.

[4]燕紅，楊謙，潘忠誠.一株地衣芽孢桿菌對稻草降解作用的研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報，2007，33（4）：360-366.

[5]祝小，耿秀蓉，潘康成，等.枯草芽孢桿菌 Pab02 產(chǎn)纖維素酶活性的研究[J].飼料研究，2007（1）：61-63.

[6]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社， 2001.

[7]霍爾特J G.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 劉復(fù)今，編譯. 簡明第8版.濟南：山東大學(xué)出版社， 1988.

[8]Kim S B， Yoon J H， Kim H， et al. A phylogenetic analysis of the genus Saccharomonospora conducted with 16S rRNA gene sequences [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1995， 45（2）： 351-356.

[9]Rainey F A， Rainey N W， Kroppenstedt R M， et al. The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage： Proposal of Nocardiopsaceae fam. nov. [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1996， 46（4）： 1088-1092.

1.3菌種鑒定

1.3.1菌株形態(tài)和生理生化鑒定根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色性狀、芽孢染色性狀及有關(guān)生理生化鑒別試驗，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進行屬和種的鑒定。

菌株形態(tài)鑒定：將復(fù)篩得到L-13菌株進行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5稀釋液于分離培養(yǎng)基上涂平板，15℃培養(yǎng)48 h得單菌落，觀察記錄菌落形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。另挑取15℃培養(yǎng)24 h的菌株，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，并進行芽孢、鞭毛染色。

生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗。主要進行H2S 產(chǎn)生試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、過氧化氫酶（接觸酶）試驗、精氨基脫羧酶試驗、淀粉水解、V.P（乙酰甲基甲醇）試驗、M.R（甲基紅）試驗、檸檬酸鹽試驗、酪素水解、糖、醇發(fā)酵試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、纖維素水解試驗、脲酶（尿素水解）試驗、丙二酸鹽試驗、硝酸鹽還原試驗和3-酮基乳糖試驗。

1.3.216S rDNA鑒定DNA提取和16S rDNA擴增：參考Kim等和Rainey等方法提取細(xì)菌總DNA。1%瓊脂糖電泳檢測。引物為通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。 PCR 反應(yīng)體系：DNA模板（70 ng/μl）2 μl；dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.5 μl；27F（20 μmol/L）1.5 μl；1495 R（20 μmol/L）1.5 μl；10×Ex Taq Buffer（Mg2+ pluse）5 μl；Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μl；補足ddH2O到50 μl。PCR條件：94℃預(yù)變性3 min； 94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將測得的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行相似性分析，將所得相近序列利用 Clustal X（1.8）進行多重序列比對（Multiple alignments），并用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1低溫降解纖維素菌株的篩選

2.1.1低溫降解纖維素菌株的初篩經(jīng)初篩得到產(chǎn)纖維素酶的菌株16株，分別命名為L-1～L-16（表1），水解圈直徑為15.2～35.3 mm，其中L-13水解圈直徑最大，為35.3 mm。

3結(jié)論

利用剛果紅纖維素鈉初篩、纖維素酶活復(fù)篩，從腐熟秸稈粉中篩選出一株低溫條件下能夠快速降解玉米秸稈的菌株L-13，根據(jù)其形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。北方冬季（12～2月）設(shè)施地溫低，多在12～20℃之間，低溫條件下能夠快速生長并高產(chǎn)纖維素酶的L-13菌種有一定的應(yīng)用前景。

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1.3菌種鑒定

1.3.1菌株形態(tài)和生理生化鑒定根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色性狀、芽孢染色性狀及有關(guān)生理生化鑒別試驗，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進行屬和種的鑒定。

菌株形態(tài)鑒定：將復(fù)篩得到L-13菌株進行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5稀釋液于分離培養(yǎng)基上涂平板，15℃培養(yǎng)48 h得單菌落，觀察記錄菌落形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。另挑取15℃培養(yǎng)24 h的菌株，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，并進行芽孢、鞭毛染色。

生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗。主要進行H2S 產(chǎn)生試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、過氧化氫酶（接觸酶）試驗、精氨基脫羧酶試驗、淀粉水解、V.P（乙酰甲基甲醇）試驗、M.R（甲基紅）試驗、檸檬酸鹽試驗、酪素水解、糖、醇發(fā)酵試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、纖維素水解試驗、脲酶（尿素水解）試驗、丙二酸鹽試驗、硝酸鹽還原試驗和3-酮基乳糖試驗。

1.3.216S rDNA鑒定DNA提取和16S rDNA擴增：參考Kim等和Rainey等方法提取細(xì)菌總DNA。1%瓊脂糖電泳檢測。引物為通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。 PCR 反應(yīng)體系：DNA模板（70 ng/μl）2 μl；dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.5 μl；27F（20 μmol/L）1.5 μl；1495 R（20 μmol/L）1.5 μl；10×Ex Taq Buffer（Mg2+ pluse）5 μl；Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μl；補足ddH2O到50 μl。PCR條件：94℃預(yù)變性3 min； 94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將測得的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行相似性分析，將所得相近序列利用 Clustal X（1.8）進行多重序列比對（Multiple alignments），并用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1低溫降解纖維素菌株的篩選

2.1.1低溫降解纖維素菌株的初篩經(jīng)初篩得到產(chǎn)纖維素酶的菌株16株，分別命名為L-1～L-16（表1），水解圈直徑為15.2～35.3 mm，其中L-13水解圈直徑最大，為35.3 mm。

3結(jié)論

利用剛果紅纖維素鈉初篩、纖維素酶活復(fù)篩，從腐熟秸稈粉中篩選出一株低溫條件下能夠快速降解玉米秸稈的菌株L-13，根據(jù)其形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。北方冬季（12～2月）設(shè)施地溫低，多在12～20℃之間，低溫條件下能夠快速生長并高產(chǎn)纖維素酶的L-13菌種有一定的應(yīng)用前景。

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