毛細(xì)管區(qū)帶電泳測定兩種生物堿與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)研究

霍鵬，朱平川，徐遠(yuǎn)金

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林541004；2.廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530004）

0 引言

鹽酸麻黃堿、磷酸可待因是毒品和藥物中常見的生物堿，其結(jié)構(gòu)式見圖1.研究表明，這些生物堿具有多種生理活性和藥理療效，如鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抑制腸胃蠕動(dòng)及抑制呼吸等，還具有一定的毒性和麻醉性，連續(xù)服用易產(chǎn)生習(xí)慣成癮問題，嚴(yán)重可導(dǎo)致用藥者精神崩潰，做出極端行為.近年來，吸毒和藥物濫用對人們的生活和社會(huì)安定構(gòu)成了極大威脅，成為備受關(guān)注的社會(huì)問題，因而對這些藥物的管理很重要［1］.血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，可以同許多內(nèi)源和外源性化合物結(jié)合，從而成為藥物小分子—蛋白質(zhì)結(jié)合研究的主要蛋白質(zhì).當(dāng)藥物自給藥部位吸收進(jìn)入血液循環(huán)后，要通過血漿的貯存和運(yùn)輸?shù)竭_(dá)受體部位才能產(chǎn)生藥理作用，因此研究鹽酸麻黃堿、磷酸可待因與牛血清白蛋白的相互作用對其在體內(nèi)的分布、清除、活性、毒性等有重要的影響，對于闡明藥物的作用機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)及藥物的毒副作用具有重要意義.

研究藥物與蛋白相互作用常用的方法主要有：紫外可見分光光度法［2］，傅立葉變換紅外光譜法［3］，熒光光譜法［4-5］，圓二色 譜 法［6］，毛 細(xì) 管 電 泳 技 術(shù)［7-9］，平衡透 析技 術(shù)［10-11］，電 化 學(xué) 技 術(shù)［12-13］，核磁共振技術(shù)［14-15］.CE作為一種新型分離技術(shù)，用于分子間相互作用的研究具有以下優(yōu)點(diǎn)：分析速度快，分離效率高，樣品用量少（nmol級），對受體的純度要求不高，可在溶液中進(jìn)行，可保持生物分子相互作用所需要的生理?xiàng)l件，更接近體內(nèi)的結(jié)合行為，有多種模式可供選擇，適用于各種親和體系等［16］.但蛋白質(zhì)大分子易被毛細(xì)管管壁吸附，使背景吸收信號增強(qiáng)、電滲流發(fā)生變化、電泳峰展寬、這都會(huì)在一定程度上影響測定結(jié)果［17］.本文中采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳，通過測定在不同濃度BSA的緩沖溶液條件下化合物遷移時(shí)間的變化，研究鹽酸麻黃堿，磷酸可待因兩種生物堿與BSA的相互作用，并計(jì)算其結(jié)合常數(shù).

圖1 兩種生物堿的結(jié)構(gòu)圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 P／ACETMMDQ毛細(xì)管電泳儀帶二極管陣列檢測器（美國Beckman公司）；未涂層彈性石英毛細(xì)管（75μm×60cm，有效長度50cm）（河北永年銳灃色譜器件有限公司）；UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；Orion 720A型酸度計(jì)／離子計(jì)（美國Thermo公司）；Synthesis A10TM超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；ME 215S電子天平（德國Sartorius公司）.

鹽酸麻黃堿、磷酸可待因（購自中國藥品生物制品檢定所）；牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma公司）；其它試劑均為分析純.

1.2 樣品溶液的配制

1.2.1 鹽酸麻黃堿、磷酸可待因溶液的配制 取鹽酸麻黃堿、磷酸可待因?qū)φ掌犯骷s10mg，精密稱定，分別置于10mL容量瓶中，用緩沖溶液溶解并定容，配成1.00mg／mL的對照品儲(chǔ)備液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，密封于4℃下冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用緩沖溶液稀釋至所需濃度.

1.2.2 牛血清白蛋白溶液的配制 稱取適量的BSA用電泳緩沖溶液配制成0.5mmol／L溶液，然后依次稀釋到0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035mmol／L的工作溶液，經(jīng)0.45μm 濾膜過濾，密封于4℃下冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.3 電泳條件 以25mmol／LTris-HCl（pH＝7.40）為電泳緩沖溶液，未涂層彈性石英毛細(xì)管（75 μm×60cm）為分離通道，壓力進(jìn)樣（3.447 5kPa×6sec），分離電壓20kV，柱溫37℃，檢測波長214 nm.緩沖溶液與樣品均用0.45μm濾膜過濾，并超聲脫氣.毛細(xì)管每天使用前，分別用0.1mol／L NaOH、超純水和緩沖溶液各沖洗10min.

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離條件的優(yōu)化

2.1.1 緩沖體系的選擇 體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體環(huán)境最常用的緩沖體系有：Tris-HCl緩沖溶液和磷酸鹽緩沖溶液，人體內(nèi)的環(huán)境是一個(gè)pH相對穩(wěn)定的緩沖體系，血液及組織液的正常pH約為7.40.因此，實(shí)驗(yàn)考察了pH 7.40條件下Tris-HCl緩沖溶液和磷酸鹽緩沖溶液對兩種組分分離的影響.結(jié)果表明：在磷酸鹽緩沖體系中，磷酸可待因靈敏度低，峰形不好；在Tris-HCl體系中，鹽酸麻黃堿和磷酸可待因可以獲得較好的分離，并且靈敏度高.因此選擇Tris-HCl體系為運(yùn)行緩沖溶液.

2.1.2 緩沖溶液濃度的影響 實(shí)驗(yàn)考察了Tris-HCl緩沖溶液濃度在15～35mmol／L范圍內(nèi)對分離的影響，濃度較小時(shí)，兩組分峰很寬，遷移時(shí)間短；隨著濃度的增大，分離度增大，靈敏度增高，遷移時(shí)間增加，而濃度過高時(shí)，組分峰遷移時(shí)間較長，基線噪音增加.當(dāng)Tris-HCl濃度為25mmol／L時(shí)，兩物質(zhì)間分離度和靈敏度達(dá)最好，遷移時(shí)間也相對較短，本實(shí)驗(yàn)選定Tris-HCl緩沖溶液的最佳濃度為25mmol／L.

2.1.3 柱溫、分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間的影響 為了近似模擬生理?xiàng)l件，選擇模擬人體體溫37℃，因此選擇柱溫為37℃，在此條件下，考察了15～30kV范圍內(nèi)分離電壓對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響.隨著分離電壓的升高，電滲流速度加快，組分的分析時(shí)間明顯縮短，峰形尖銳.當(dāng)分離電壓達(dá)到20kV時(shí)，兩種組分在5 min內(nèi)可獲得很好的基線分離.因此，選擇分離電壓為20kV.

固定3.447 5kPa的壓力進(jìn)樣，在6～12s范圍內(nèi)改變進(jìn)樣時(shí)間.實(shí)驗(yàn)表明進(jìn)樣時(shí)間越長，靈敏度越高，但隨著進(jìn)樣量的增大，溶質(zhì)區(qū)帶加寬，分離度下降，選擇進(jìn)樣時(shí)間為6s.

2.2 鹽酸麻黃堿、磷酸可待因與BSA的相互作用

2.2.1 定性分析 在25℃下，用紫外分光光度法考查鹽酸麻黃堿、磷酸可待因分別與BSA混合物（V∶V＝1∶1）的吸光度值，隨著蛋白質(zhì)與藥物的結(jié)合，混合物的吸收值降低，圖2為0.1mmol／L鹽酸麻黃堿、磷酸可待因與0.1mmol／L BSA混合后的紫外光譜圖.在波長278nm處，未檢測到鹽酸麻黃堿和磷酸可待因的吸收峰，隨著鹽酸麻黃堿和磷酸可待因的加入，BSA的吸收峰下降，說明了牛血清白蛋白與兩種藥物均存在相互作用.

圖2 0.1mmol／L BSA （a）、0.1mmol／L磷酸可待因與0.1mmol／L BSA （b）、0.1mmol／L鹽酸麻黃堿與0.1mmol／L BSA（c）混合后的紫外光譜

2.2.2 定量分析 采用毛細(xì)管電泳淌度移動(dòng)法測定兩種生物堿類藥物小分子與BSA的結(jié)合常數(shù)，將BSA（P）加入到緩沖溶液中，將生物堿類藥物小分子（M）作為樣品，按優(yōu)化后的電泳條件進(jìn)行檢測，二者發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，形成結(jié)合物（MP），根據(jù)溶液中電泳淌度的變化，假設(shè)結(jié)合比為1∶1，即：

其中Kb為藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，［M］和［P］分別為平衡體系中游離化合物M和游離蛋白質(zhì)P的濃度，［MP］為化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合得到的復(fù)合物的濃度.

依據(jù)色譜原理可推導(dǎo)出：

式中，φ為相比（Vs／Vm），s和m分別代表固相和液相，［M］s表示與BSA結(jié)合的藥物小分子的濃度，［M］mo為當(dāng)緩沖溶液中無BSA存在時(shí)藥物小分子的原始濃度.容量因子k可表示為：

（式中tr表示緩沖溶液中添加BSA后藥物的遷移時(shí)間；tion表示緩沖溶液中無BSA存在時(shí)藥物的遷移時(shí)間；tmc表示BSA的遷移時(shí)間）

根據(jù)方程（3）作k-［P］線性回歸圖，得到直線的斜率和截距，計(jì)算結(jié)合常數(shù)Kb，結(jié)果見表1.

實(shí)驗(yàn)表明，兩種藥物小分子與BSA均發(fā)生了一定程度的相互作用.由表1可以看出，所得到的兩條回歸直線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9，說明本實(shí)驗(yàn)所作的化合物與BSA的結(jié)合摩爾比為1∶1以及化合物的保留行為與色譜方法中相似的假設(shè)是合理的.化合物與BSA的結(jié)合常數(shù)均在104L／mol數(shù)量級，說明藥物與蛋白質(zhì)分子之間存在著較強(qiáng)的相互作用.

表1 兩種生物堿與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)

圖3所示為兩種生物堿類藥物小分子在不同濃度BSA電泳緩沖溶液中的毛細(xì)管電泳譜圖，由圖可看出，隨著BSA的濃度由0mmol／L增加至0.035mmol／L，藥物小分子的保留時(shí)間逐漸增大，二者之間的分離情況也得到了明顯的改善，主要是因?yàn)殡S著BSA濃度的增大，電泳緩沖溶液的粘度以及和毛細(xì)管壁的作用發(fā)生了變化，在電泳譜圖上表現(xiàn)為出峰延后，并且隨蛋白含量的進(jìn)一步增大，相互作用逐漸增強(qiáng)，峰形也會(huì)相應(yīng)出現(xiàn)變矮，展寬嚴(yán)重的趨勢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是由于結(jié)合作用生成了結(jié)合物，而結(jié)合物和游離藥物的電荷數(shù)不同，離子半徑相差較大，從而使二者的電泳淌度不一致.

圖3 鹽酸麻黃堿和磷酸可待因的毛細(xì)管電泳圖

3 結(jié)論

本文中利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，通過兩種生物堿在不同濃度下的BSA遷移行為的變化，計(jì)算得到其與BSA的結(jié)合常數(shù)均為104L／mol數(shù)量級，這對藥物與白蛋白的結(jié)合規(guī)律和機(jī)理的進(jìn)一步探討具有重要意義.該方法簡便、快速，具有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，在研究小分子與生物大分子的弱相互作用方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

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