響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲提取芒果葉中芒果苷的工藝研究

張 青，王志祥，宋立丹，樂(lè) 龍(中國(guó)藥科大學(xué)制藥工程教研室，南京 210009)

芒果葉為漆樹(shù)科植物芒果MangiferaindicaL.的葉，芒果葉的藥理作用主要有平喘、止咳、祛痰、免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝利膽、抗病毒、抗腫瘤、抗菌等[1]。芒果苷又名芒果素、知母寧，是芒果葉的主要活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、退熱、鎮(zhèn)痛、抗寄生蟲(chóng)、神經(jīng)保護(hù)等作用[2]。超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)以及其他次級(jí)效應(yīng)能夠在不改變有效成分結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，縮短提取時(shí)間，節(jié)約提取溶劑，提高提取率[3-4]。本文采用超聲波法提取芒果葉中的芒果苷，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法進(jìn)行工藝優(yōu)化，利用Design-Expert8.0.5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得出超聲提取芒果葉中的芒果苷的最佳優(yōu)化工藝參數(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DCTZ-2000型三頻多用途恒溫超聲波提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；BT25S 型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 材料 芒果葉購(gòu)于廣東省廣州市；芒果苷對(duì)照品(批號(hào)：MUST-11110201) 購(gòu)于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)網(wǎng)；甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)；乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 芒果苷樣品的提取 將已干燥的芒果葉粉碎，過(guò)10～120 目篩，每次稱(chēng)取2 g粉末放于超聲提取機(jī)的反應(yīng)釜中，再加入一定量的乙醇溶液，超聲提取后，減壓抽濾，量取濾液的體積，精確移取100 μL濾液于10 mL量瓶中，并用流動(dòng)相甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液(20∶80)定容。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2.2 芒果苷的含量測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件[5]VP-ODS反相色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流動(dòng)相：甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液(20∶80)；檢測(cè)波長(zhǎng):258 nm；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密稱(chēng)取芒果苷對(duì)照品2.94 mg,置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容于刻度線(xiàn)處。分別精密吸取100，200，400，600，800和1 000 μL，置于6個(gè)10mL量瓶中，并用流動(dòng)相定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以芒果苷對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得回歸方程：Y=104 115X-151 149,r=0.999 7。結(jié)果表明，芒果苷進(jìn)樣量在2.94～29.4 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.3 芒果苷的含量測(cè)定 采用外標(biāo)峰面積法計(jì)算芒果苷的含量，最終得芒果的提取率：

式中:η為芒果苷的提取率(%)，A為芒果苷的峰面積，V為濾液體積(mL)，n為稀釋倍數(shù)，m為芒果葉的質(zhì)量(mg)

2.3 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[6-7]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以芒果苷提取率(Y)為響應(yīng)值，選取液料比(A)、超聲功率(B)、提取時(shí)間(C)和提取溫度(D)4個(gè)因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)因素水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。用Design-Expert8.0.5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得芒果苷提取率(Y)對(duì)液料比(A)、超聲功率(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=4.04+0.11A+0.14B-0.22C-0.016D

-0.11AB+0.14AC-0.19AD-0.29BC

-0.10BD+0.025CD-0.54A2-0.36B2

-0.40C2-0.44D2

模型方差分析結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

表3 響應(yīng)曲面回歸模型方差分析

3.2 響應(yīng)曲面的分析與優(yōu)化 利用Design-Expert8.0.5.0軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖及其等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖1、圖2和圖3。3組圖直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)曲面圖可以反映各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線(xiàn)的形狀可以反映出交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。

圖1 液料比與提取溫度對(duì)芒果苷提取率影響的響應(yīng)面圖(a)和等高線(xiàn)圖(b)

圖2 液料比與提取時(shí)間對(duì)芒果苷提取率影響的響應(yīng)面圖(a)及等高線(xiàn)圖(b)

圖3 超聲功率與提取溫度對(duì)芒果苷提取率影響的響應(yīng)面圖(a)及等高線(xiàn)圖(b)

從圖1(a)中的響應(yīng)面圖可以看出，當(dāng)提取溫度在45 ℃附近、液料比在50 mL·g-1附近，芒果苷提取率達(dá)到了最大值，說(shuō)明最佳提取溫度和最佳液料比在實(shí)驗(yàn)選取的范圍內(nèi)。從圖1(b)的等高線(xiàn)圖中可以看出,沿溫度方向峰值移動(dòng)，等高線(xiàn)密度大于沿料液比方向，說(shuō)明溫度對(duì)效應(yīng)值的貢獻(xiàn)更大。

從圖2(a)中的響應(yīng)面圖中可以看出，在一定的提取時(shí)間，芒果苷提取率隨液料比的增大先快速增大后又緩慢減??；隨著提取時(shí)間的由小變大，芒果苷提取率變化不明顯，只是略有一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì)。從圖2(b)等高線(xiàn)圖中可以看出，沿液料比方向峰值移動(dòng)，等高線(xiàn)密度大于沿提取時(shí)間方向，表明液料比對(duì)效應(yīng)值的貢獻(xiàn)更大。

從圖3(a)的響應(yīng)面圖中可以看出，當(dāng)超聲功率一定時(shí)，芒果苷提取率隨著溫度的升高先增大后減小。當(dāng)溫度一定時(shí)，芒果苷提取率隨著超聲功率的增大逐漸增大，然后略有下降。從圖3(b)等高線(xiàn)圖中可以看出，沿提取溫度方向峰值移動(dòng)，等高線(xiàn)密度大于沿超聲功率方向，說(shuō)明提取溫度對(duì)效應(yīng)值的貢獻(xiàn)更大。所得結(jié)論均與方差分析結(jié)果一致。

3.3 條件優(yōu)化、預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 通過(guò)軟件求解回歸方程，得出最佳提取工藝條件為：液料比為50.24mL·g-1，超聲功率為437.52 W，提取溫度為45.80 ℃，提取時(shí)間為29.61 min，芒果苷提取率預(yù)測(cè)值為4.11%。考慮到實(shí)際的可操作性，將優(yōu)化工藝條件修正為：液料比50 mL·g-1，超聲功率為438 W，提取溫度46 ℃，提取時(shí)間30 min，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，所得芒果苷提取率的平均值為4.04%。與預(yù)測(cè)值較為相近，因此所得到的最佳優(yōu)化工藝可靠，具有一定的使用價(jià)值。

4 結(jié)論

本文采用超聲波法提取芒果葉中的芒果苷，通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)芒果苷提取工藝的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳優(yōu)化工藝條件為：液料比50 mL·g-1，超聲功率為438 W，提取溫度46 ℃，提取時(shí)間30 min，在此條件下，芒果苷提取率為4.04 %，與預(yù)測(cè)值接近。因此，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲提取芒果葉中的芒果苷，得到的工藝條件具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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