高效液相色譜法測定草龍中沒食子酸的含量

周小雅，梁光毅，劉雪梅(.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530023；2.廣西梧州市桂康藥業(yè)有限公司，梧州 543000，3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530022)

草龍為廣西壯族民間常用中草藥，為柳葉菜科植物線葉丁香蓼(Ludwigiahyssopifolia(G. Don)Exell)的干燥全草，具有清熱解毒、祛腐生肌功效，用于治療感冒、咽喉腫痛、瘡疥等[1]。民間使用已證明該藥有較顯著的療效，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。但因缺乏專屬性的化學(xué)對照品，草龍的質(zhì)量控制研究方面的報(bào)道還是空白，阻礙了草龍藥材的臨床應(yīng)用。

有文獻(xiàn)報(bào)道，對草龍的化學(xué)成分和抑菌的藥理作用進(jìn)行系統(tǒng)研究[2]。藥理研究表明，從乙酸乙酯部位分得的單體沒食子酸有較好抑菌作用[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)以沒食子酸為指標(biāo)成分，采用TLC建立了沒食子酸的薄層鑒別方法，并用高效液相色譜法檢測草龍中沒食子酸含量，為草龍藥材的制劑開發(fā)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 752N紫外可見分光光度計(jì)(上海分析儀器廠)；LC210高效液相色譜儀(上海分析儀器廠)。

1.2 試藥 沒食子酸(購于中國藥品生物制品檢定所，批號110831-200803：)；乙腈(色譜純)；0.5mL·L-1磷酸溶液；草龍采于廣西南寧地區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院中藥研究所劉壽養(yǎng)副教授鑒定為柳葉菜科丁香蓼屬植物線葉丁香蓼(Ludwigiahyssopifolia(G. Don)Exell)的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 沒食子酸的薄層檢識

2.1.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品約2 mg，加適量甲醇溶解，搖勻，作為對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備 取草龍粗粉約1 g，置于50 mL量瓶中，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，放冷，搖勻，濾過，取濾液10 mL于水浴上濃縮至約1 mL，即得。

2.1.3 沒食子酸的薄層鑒定 照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)，吸取上述對照品和樣品溶液適量，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(3∶5.4∶0.6)為展開劑，薄層板置展開缸中預(yù)飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以50 g·L-1的磷鉬酸，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，證明草龍藥材中含有沒食子酸。

2.2 沒食子酸含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.5 mL·L-1磷酸(5∶95)；流速:1.00 mL·min-1；檢測波長為270 nm；柱溫：28 ℃。理論板數(shù)按沒食子酸計(jì)算應(yīng)不少于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品約8 mg，精密稱定，加甲醇溶解，并定溶至10 mL量瓶中，作為對照品溶液，質(zhì)量濃度為0.80 mg·mL-1。

2.2.3 供試品溶液的制備 取草龍藥材粗粉約1 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，精密加入蒸餾水25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用蒸餾水補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 在2.2.1項(xiàng)下色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5和3.0 μL進(jìn)行測定，以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=2 388.1X+25.797(r=0.999 9)，結(jié)果表明，沒食子酸進(jìn)樣量在0.4～2.4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對照品溶液2 μL(0.80 mg·mL-1)，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，平均值3 852.55，RSD為0.98%(n=5)，表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將供試品溶液常溫保存，分別在0，4，8，16和24 h精密吸取5 μL，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測定。結(jié)果沒食子酸含量分別為3.14，3.04，3.07，3.06和3.16 mg·g-1，平均含量為3.09 mg·g-1，RSD為2.08%(n=5)。說明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批草龍藥材，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備5份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果沒食子酸含量分別為3.14，3.10，3.11，3.02和3.06 mg·g-1，平均含量為3.09 mg·g-1，RSD為1.51%(n=5)。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的草龍藥材粗粉0.5 g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入沒食子酸對照品適量，按供試品溶液制備方法制備，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。平均回收率為98.36%，RSD為2.28%。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 樣品測定 取3份草龍藥材粗粉各1 g，精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，濾過，分別取續(xù)濾液5 μL進(jìn)樣，用峰面積按外標(biāo)法計(jì)算，沒食子酸的平均含量為3.15 mg·g-1，RSD為2.95%(n=3)。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道，用高效液相色譜法測定沒食子酸的含量[4]，使用的流動(dòng)相系統(tǒng)比較多[5-7]。本實(shí)驗(yàn)通過比較，以水、甲醇作為溶劑和超聲提取的測定結(jié)果，最終選擇以水作為溶劑，采用超聲提取法制備草龍供試品，以乙腈-磷酸水溶液、水-二甲基甲酰胺-冰醋酸、乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以乙腈-0.5 mL·L-1磷酸水溶液(5∶95) 為流動(dòng)相，測定草龍中的沒食子酸的含量，分離效果較好，保留時(shí)間適宜。

本實(shí)驗(yàn)所采用方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，對草龍的質(zhì)量進(jìn)行了薄層鑒別和含量測定，對草龍藥材的品質(zhì)評價(jià)和質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義。

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