花生粕的枯草芽孢桿菌BS H001發(fā)酵及產(chǎn)物性質(zhì)*

劉冬梅 陳浩 胡小慧 吳暉 李理

(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

花生粕(PNM)是花生仁經(jīng)壓榨提煉油料后所得的副產(chǎn)品，其粗蛋白質(zhì)含量為38.0%～47.0%，粗纖維含量為4.0%～7.0%，粗脂肪含量為0.5%～2.0%，鈣含量為0.2%～0.3%，磷(以植酸磷形式存在)含量為0.4%～0.7%［1］.我國(guó)花生粕的年產(chǎn)量約為1000 萬(wàn)噸，居世界第一位，約占世界總產(chǎn)量的38%［2］.但以下3 個(gè)主要缺陷限制了花生粕在飼料和食品行業(yè)的應(yīng)用:(1)花生粕中的氨基酸不平衡，特別是缺乏一些必需氨基酸(如賴(lài)氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸);(2)花生粕易感染黃曲霉從而產(chǎn)生黃曲霉毒素，將其作為牲畜飼料時(shí)易使牲畜肝臟受到損害;(3)花生蛋白質(zhì)中存在過(guò)敏原.花生粕中氨基酸的缺陷可通過(guò)添加氨基酸或其他蛋白質(zhì)來(lái)彌補(bǔ)，黃曲霉毒素的危害可通過(guò)將花生粕用量控制在10%以下或利用堿或微生物發(fā)酵降解的方法來(lái)減輕［3］，花生蛋白質(zhì)中的過(guò)敏原可采用枯草芽孢桿菌來(lái)降解.枯草芽孢桿菌被用于許多大豆發(fā)酵食品的發(fā)酵，如泰國(guó)的Thua-Nao、日本的納豆和中國(guó)的豆豉等［4-6］，這些發(fā)酵食品都利用枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶使大分子蛋白質(zhì)水解成小分子蛋白質(zhì)，因此其蛋白質(zhì)有較好的生物效價(jià)［7］;同時(shí)，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵作用使食品中蛋白質(zhì)類(lèi)過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在降低過(guò)敏反應(yīng)的同時(shí)，增加了食品中游離氨基酸和多肽的含量［8-10］.目前，在利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕生產(chǎn)易消化的蛋白質(zhì)飼料方面已有較多研究［11-13］，但利用其進(jìn)行花生粕發(fā)酵的研究則很少，尚未實(shí)現(xiàn)發(fā)酵花生粕(FPNM)的規(guī)?；a(chǎn)，更沒(méi)有涉及到PNM 發(fā)酵前后的氨基酸種類(lèi)及含量變化.

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS H001(Bacillus subtilis BS H001)能對(duì)PNM 進(jìn)行發(fā)酵，還能降解其中的黃曲霉毒素［14］.為改善PNM 中的氨基酸平衡，減少花生蛋白質(zhì)中的過(guò)敏原，文中對(duì)BS H001 發(fā)酵PNM 的條件、FPNM 中蛋白質(zhì)的部分性質(zhì)和發(fā)酵前后的氨基酸變化進(jìn)行了研究.

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌BS H001 由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院分離并保存;斜面培養(yǎng)基組成如下:牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂2 g/L，pH=7.0;種子培養(yǎng)基除不加瓊脂外，其余組成與斜面培養(yǎng)基相同.

鹽酸、硫酸銅、乙醇均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn);氫氧化鈉、硫酸鉀、乙醚、硼酸均為分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn);碳酸鈉、濃硫酸、甲醇、冰醋酸均為分析純，天津市科密化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷、四甲基乙二胺、β-巰基乙醇、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-250、標(biāo)準(zhǔn)蛋白(分子質(zhì)量為24～97 ku)均為分析純，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn).

1.2 主要儀器

KDC-40 型低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn);5804R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf AG 22331，德國(guó)艾本得中國(guó)有限公司生產(chǎn);DYY-6C 型電泳儀及電泳槽，北京市六一儀器廠生產(chǎn);J-2 型菌落計(jì)數(shù)器，寧波科學(xué)儀器廠生產(chǎn);ALPHA1-2型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ 有限公司生產(chǎn);PQX 型多段可控人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司生產(chǎn);自動(dòng)凱氏定氮儀，瑞士Büchi 公司生產(chǎn);醫(yī)學(xué)低溫冰箱，青島海爾集團(tuán)生產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BS H001 菌種的活化及種子液的制備

(1)BS H001 菌種的活化

根據(jù)配方配制種子培養(yǎng)基，于121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min 后冷卻，接入BS H001，于30 ℃下培養(yǎng)24 h 后，為母種子液.

(2)BS H001 種子液的制備

根據(jù)配方配制種子培養(yǎng)基，于121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min 后冷卻，接入母種子液，在30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h 后，BS H001 細(xì)胞濃度達(dá)1.0 ×109～3.0 ×109CFU/mL，為種子液.

1.3.2 PNM 的發(fā)酵

在50 g PNM 中加入適量的水和硫酸銨，攪拌均勻后，裝入150 mL 的錐形瓶中，封口，在0.1 MPa 下滅菌一定時(shí)間后冷卻至30 ℃，按2%～10%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)接種BS H001 種子液，攪拌均勻后，于30 ℃下發(fā)酵一定時(shí)間，在發(fā)酵期間定期攪拌，發(fā)酵結(jié)束后的PNM 進(jìn)行真空冷凍干燥.

1.3.3 蛋白質(zhì)含量分析

利用凱氏定氮法來(lái)測(cè)定PNM 的蛋白質(zhì)含量.取烘干至恒重的PNM 或FPNM 5 g 與硫酸、硫酸銅、硫酸鉀加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解后的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，再用硼酸吸收，以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，將酸消耗量乘以換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量.做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，即得蛋白質(zhì)含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同).

1.3.4 硫酸銨氮含量測(cè)定

取烘至恒重的PNM 或FPNM 5 g 溶于雙蒸水并定容至100mL，溶液在8000r/min 下離心20min 后，取上清液10 mL，加堿蒸餾使氨游離，再用硼酸吸收，以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，將酸消耗量乘以換算系數(shù)，即得剩余的硫酸銨氮含量.做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值.將所得的蛋白質(zhì)含量減去剩余的硫酸銨氮含量，即得剔除硫酸銨中氮的蛋白質(zhì)含量.

1.3.5 BS H001 發(fā)酵PNM 的單因素實(shí)驗(yàn)

(1)含水量的影響實(shí)驗(yàn)

PNM 分別在33%、50%、60%、67%、71%的含水量下進(jìn)行實(shí)驗(yàn).其他發(fā)酵條件如下:發(fā)酵時(shí)間48 h、攪拌間隔8 h、滅菌時(shí)間20 min、硫酸銨含量2.0%.

(2)發(fā)酵時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)

分別在24、36、48、60、72 h 的發(fā)酵時(shí)間下進(jìn)行實(shí)驗(yàn).其他發(fā)酵條件如下:含水量50%、攪拌間隔8 h、滅菌時(shí)間20 min、硫酸銨含量2.0%.

(3)攪拌間隔的影響實(shí)驗(yàn)

分別在0(不攪拌)、4、8、12、16 h 的攪拌間隔下進(jìn)行實(shí)驗(yàn).其他發(fā)酵條件如下:含水量50%、發(fā)酵時(shí)間48 h、滅菌時(shí)間20 min、硫酸銨含量2.0%.

(4)滅菌時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)

分別在0、10、20、30、40 min 的滅菌時(shí)間下進(jìn)行實(shí)驗(yàn).其他發(fā)酵條件如下:含水量50%、發(fā)酵時(shí)間48 h、攪拌間隔8 h、硫酸銨含量2.0%.

(5)硫酸銨含量的影響實(shí)驗(yàn)

分別在0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，余同)的硫酸銨含量下進(jìn)行實(shí)驗(yàn).其他發(fā)酵條件如下:含水量50%、發(fā)酵時(shí)間48 h、攪拌間隔8 h、滅菌時(shí)間20 min.

1.3.6 BS H001 發(fā)酵PNM 的多因素實(shí)驗(yàn)

即使采用最優(yōu)的單因素條件，各因素之間的交互作用也會(huì)影響B(tài)S H001 的發(fā)酵，因此需考慮多因素的交互作用對(duì)PNM 發(fā)酵的影響.文中進(jìn)行了5 因素4 水平正交試驗(yàn)，5 因素分別為PNM 的含水量(因素A，分別取44%、47%、50%、52%)、PNM 發(fā)酵時(shí)間(因素B，分別取40、44、48、52 h)、攪拌間隔(因素C，分別取4、6、8、10 h)，滅菌時(shí)間(因素D，分別取30、35、40、45 min)、硫酸銨含量(因素E，分別取3.0%、4.0%、5.0%、6.0%).根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)了共16 組實(shí)驗(yàn)，分別按照1.3.3 和1.3.4節(jié)的方法測(cè)定每組的蛋白質(zhì)含量和硫酸銨氮含量，每組做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值.

1.3.7 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布的SDS-PAGE 分析

(1)蛋白質(zhì)的提?。?5］

分別將發(fā)酵前后的PNM 粉碎，用乙醚(花生粉與乙醚質(zhì)量比為1∶6)脫脂3 次，除去脫出的脂肪并在通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干乙醚，脫脂PNM 粉用10 倍體積的蒸餾水分散攪拌完全，再用NaOH 調(diào)至pH 9.5，室溫下攪拌2 h 后離心30 min.離心所得上清液用HCl調(diào)至pH 4.6，于4℃下放置2h 后，離心.所得沉淀用蒸餾水洗3 次后重新分散于蒸餾水中，調(diào)至中性，該分散液經(jīng)透析后冷凍干燥，即得花生分離蛋白.

(2)樣品處理

在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)上處理蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品.分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.2%和2.4%.蛋白質(zhì)樣品與1.00mL 樣品緩沖液于離心管中混勻，在100℃水浴中加熱5 min，取出冷卻后于每個(gè)樣品槽中注入16.00 μL 樣品液.

(3)電泳條件

電泳實(shí)驗(yàn)采取恒流方式.電流先取10 mA，待進(jìn)入分離膠后改為25 mA;電泳2.5 h 后，進(jìn)行剝膠、染色、脫色、拍照保存.

1.3.8 蛋白質(zhì)中氨基酸種類(lèi)及含量的HPLC 分析

按1.3.7 節(jié)所述方法提取PNM 和FPNM 中的蛋白質(zhì)溶于6mol/L HCl 溶液，于110℃水解24h，再用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析檢測(cè).分析柱為PICO.TAG 氨基酸;檢測(cè)條件為:溫度38 ℃、波長(zhǎng)254 nm、流速1.00 mL/min、進(jìn)樣量10 μL.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 PNM 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 PNM 含水量的影響

PNM 含水量分別為33%、50%、60%、67%、71%時(shí)的發(fā)酵結(jié)果如圖1 所示.隨著含水量的增加，F(xiàn)PNM 中的蛋白質(zhì)含量逐漸增大;含水量為33%時(shí)，蛋白質(zhì)含量達(dá)47.56%;含水量為50%時(shí)，蛋白質(zhì)含量達(dá)最大值，為53.68%;然后逐漸下降，含水量為71% 時(shí)蛋白質(zhì)含量降至51.30%.與未發(fā)酵PNM 的蛋白質(zhì)含量(45.51%)相比，含水量為50%時(shí)發(fā)酵PNM 的蛋白質(zhì)含量呈顯著性增大(P ≤0.001)，這可能是因?yàn)楹线m的含水量令PNM 充分溶脹，使BS H001 能利用充分溶脹的蛋白質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵并產(chǎn)生菌體，從而增加了總蛋白質(zhì)的含量.但是，PNM 含水量過(guò)高或過(guò)低都不利于菌體的生長(zhǎng)繁殖，含量水過(guò)高會(huì)使PNM 結(jié)塊成團(tuán)，通氣狀況差，不利于菌體的生長(zhǎng)繁殖;含水量過(guò)低則菌體無(wú)法利用未充分溶脹的蛋白質(zhì).文中采用凱氏定氮法測(cè)定PNM發(fā)酵前后的蛋白質(zhì)含量，此法測(cè)定的是總氮含量，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的PNM 蛋白質(zhì)含量都比未發(fā)酵的高，充分說(shuō)明發(fā)酵后PNM 中蛋白質(zhì)的增加是由于菌體大量積累而致.因此，在利用枯草芽孢桿菌BS H001發(fā)酵PNM 時(shí)，控制含水量非常重要.

圖1 含水量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)FPNM 中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of water content and fermentation time on the protein content of FPNM

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間分別為24、36、48、60、72 h 時(shí)的發(fā)酵結(jié)果如圖1 所示.隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)PNM 中的蛋白質(zhì)含量增大，到48～72 h 時(shí)趨于穩(wěn)定;發(fā)酵時(shí)間為24、48 h 時(shí)，蛋白質(zhì)含量分別達(dá)到52.25%、53.61%，與未發(fā)酵PNM 的蛋白質(zhì)含量(45.51%)相比，發(fā)酵時(shí)間為48 h 時(shí)FPNM 的蛋白質(zhì)含量呈顯著性增大(P≤0.001).發(fā)酵48 h 后，蛋白質(zhì)含量增加不明顯，這可能與菌株生長(zhǎng)期有關(guān).從效果和經(jīng)濟(jì)的角度考慮，發(fā)酵時(shí)間選擇48 h 為宜.將枯草芽孢桿菌接種于豆粕中優(yōu)化產(chǎn)蛋白酶的酶活，當(dāng)發(fā)酵72 h 時(shí)蛋白酶的活力最高［16］，這是因?yàn)榈鞍酌阜置谝t于細(xì)胞數(shù)量的增殖.

2.1.3 攪拌間隔的影響

攪拌間隔分別為0、4、8、12、16 h 時(shí)的發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖2.隨攪拌間隔的延長(zhǎng)，F(xiàn)PNM 中的蛋白質(zhì)含量先增大，隨后逐漸降低;發(fā)酵過(guò)程中不攪拌時(shí)，蛋白質(zhì)含量?jī)H為50.12%;攪拌間隔為8 h 時(shí)，蛋白質(zhì)含量增至53.00%;攪拌間隔為16 h 時(shí)，蛋白質(zhì)含量下降至50.24%.與不攪拌時(shí)的FPNM 蛋白質(zhì)含量(50.12%相)比，攪拌間隔為8 h 時(shí)FPNM 中的蛋白質(zhì)含量呈顯著性增大(P≤0.001).每4 h 攪拌一次時(shí)，雖然可增加含氧量，但因攪拌過(guò)于頻繁，過(guò)度的剪切力可能會(huì)影響菌體生長(zhǎng)，因此蛋白質(zhì)含量比每8、12 h 攪拌一次時(shí)低，比不攪拌、每16 h 攪拌一次時(shí)高.BS H001 是需氧菌，PNM 中的氧氣含量對(duì)其生長(zhǎng)繁殖至關(guān)重要，攪拌既可以給菌體通氧，也可以降低菌體的發(fā)酵溫度，在半固體發(fā)酵過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)繁殖會(huì)產(chǎn)熱［17］，因此，保持菌體在合適的生長(zhǎng)范圍非常重要.

圖2 攪拌間隔和滅菌時(shí)間對(duì)FPNM 中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of stirring interval and sterilization time on the protein content of FPNM

2.1.4 滅菌時(shí)間的影響

滅菌時(shí)間分別為0、10、20、30、40 min 時(shí)的發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖2.隨滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)PNM 中的蛋白質(zhì)含量逐漸增大;不滅菌時(shí)FPNM 的蛋白質(zhì)含量?jī)H為50.18%;滅菌20 min 時(shí)，F(xiàn)PNM 的蛋白質(zhì)含量增加至53.67%;滅菌時(shí)間為40 min 時(shí)，蛋白質(zhì)含量相應(yīng)地增加至54.66%.與不滅菌時(shí)相比，滅菌40 min 時(shí)的蛋白質(zhì)含量呈顯著性增大(P≤0.001)，但滅菌時(shí)間為20、30 min 時(shí)蛋白質(zhì)含量增大的顯著性不如40 min時(shí)(P≤0.005)，因此滅菌時(shí)間選擇40 min 為宜.這可能是因?yàn)?，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)PNM 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越疏松，其中的蛋白質(zhì)被菌株BS H001 利用得越充分，細(xì)胞增殖越多，表現(xiàn)為FPNM 中蛋白質(zhì)含量的增加.上述結(jié)果也表明，不滅菌或者滅菌不足的PNM 中會(huì)存在雜菌且蛋白質(zhì)舒展不夠，使得蛋白質(zhì)無(wú)法得到充分利用，影響B(tài)S H001 的細(xì)胞增殖，從而影響蛋白質(zhì)含量的提高.

2.1.5 硫酸銨含量的影響

硫酸銨含量分別為0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%時(shí)FPNM 的蛋白質(zhì)含量如圖3 所示.隨硫酸銨含量增加，F(xiàn)PNM 中的蛋白質(zhì)含量逐漸增大;硫酸銨含量為4.0% 時(shí)，F(xiàn)PNM 的蛋白質(zhì)含量為54.75%(未剔除硫酸銨中氮的蛋白質(zhì)含量為55.48%)，與硫酸銨含量為0.0% 時(shí)相比呈顯著性增大(P ≤0.001).硫酸銨是一種無(wú)機(jī)氮源，含量太高可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓不適［18］，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，因此其用量非常關(guān)鍵.當(dāng)硫酸銨含量較低時(shí)，菌體可較好利用，根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，硫酸銨含量最大為4.0%.盡管如此，發(fā)酵后的PNM 中還可能存在未被利用的硫酸銨，為減少其對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，考慮剔除硫酸銨中的氮含量，結(jié)果見(jiàn)圖3.可以看出，剔除硫酸銨中的氮含量后蛋白質(zhì)含量的變化趨勢(shì)相同，表明1.0%～4.0%的硫酸銨含量能促進(jìn)BS H001 的生長(zhǎng)繁殖.

圖3 硫酸銨含量對(duì)FPNM 中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effects of ammonium sulfate content on the protein content of FPNM

2.2 多因素交互作用對(duì)BS H001 發(fā)酵PNM的影響

為了獲得更高的蛋白質(zhì)含量，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了5 因素4 水平的正交試驗(yàn)，共16 組試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1.從表中可看出，BS H001 發(fā)酵PNM的最適合發(fā)酵條件為A3-B1-C3-D4-E2(實(shí)驗(yàn)組別為9)，即含水量50%、發(fā)酵40 h、每隔8 h 攪拌1 次、滅菌45 min、硫酸銨含量4.0%，此條件下FPNM 的蛋白質(zhì)含量高達(dá)55.93%(未剔除硫酸銨中氮含量的為56.78%)，比PNM 的蛋白質(zhì)含量(45.51%)提高了10.42 個(gè)百分點(diǎn).其中，5 個(gè)因素影響的先后次序依次為含水量(級(jí)差RA=1.63)＞滅菌時(shí)間(級(jí)差RD=0.99)＞攪拌間隔(級(jí)差RC=0.92)＞硫酸銨含量(級(jí)差RE=0.69)＞發(fā)酵時(shí)間(級(jí)差RB=0.65).根據(jù)正交試驗(yàn)還得出，含水量52%、發(fā)酵44 h、攪拌間隔8 h、滅菌時(shí)間45 min、硫酸銨含量4.0% 時(shí)，F(xiàn)PNM 的蛋白質(zhì)含量為56.20%，比PNM 的蛋白質(zhì)含量提高了23.49%.

表1 發(fā)酵PNM 的正交直觀分析Table 1 Intuitive analysis of the orthogonal experiment results of fermented peanut meal

2.3 發(fā)酵對(duì)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布的影響

選取表1 中發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量較高的實(shí)驗(yàn)組4、6、9、10、11、13、14、15、16 中的FPNM 和PNM 蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果如圖4 所示.PNM蛋白質(zhì)中從上至下分別有3 種蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量分別約為63、48、41 ku，經(jīng)過(guò)枯草芽孢菌BS H001 發(fā)酵后，PNM 中的蛋白質(zhì)得到了不同程度的降解，其中分子質(zhì)量約為63、48 ku 的蛋白質(zhì)被完全降解，實(shí)驗(yàn)組4、6、10、11、14 中分子質(zhì)量為41 ku 的蛋白質(zhì)未被降解，而實(shí)驗(yàn)組9、13、15、16 中蛋白質(zhì)的降解最徹底，3 種分子質(zhì)量的蛋白都被完全降解.從花生蛋白質(zhì)中已經(jīng)分離到11 種花生過(guò)敏原，分別以Ara h1－Ara h11 命名，它們屬于2 個(gè)主要的花生球蛋白和花生伴球蛋白家族，其中Ara h1 占花生蛋白總量的12%～16%，分子質(zhì)量約為63.5 ku，是花生中致敏性最強(qiáng)的組分之一，在自然狀態(tài)下以三聚體形式存在，三聚 體 的 分 子 質(zhì) 量 約 為150～200 ku［19］.BS H001 的發(fā)酵作用一方面可以提高發(fā)酵后PNM 中的蛋白質(zhì)含量，另一方面可以降解PNM 中高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，可能有助于PNM 中蛋白質(zhì)過(guò)敏原的去除或減少，從而提高PNM 蛋白質(zhì)的生物效價(jià)，為PNM的深入利用提供可能.在豆粕中接種枯草芽孢桿菌，該菌可以利用其中的蛋白質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生大量蛋白酶，將豆粕中高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)降解成肽、氨基酸等小分子物質(zhì)［20］，其中的抗原蛋白得到降解，蛋白質(zhì)含量得到提高，氨基酸組成和含量和發(fā)生了改變［21］.因此，BS H001 用于發(fā)酵PNM 有非常好的潛在價(jià)值.

圖4 PNM 發(fā)酵前后蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 電泳圖Fig.4 SDS-PAGE photo of PNM before and after fermentation

2.4 發(fā)酵對(duì)PNM 中氨基酸含量的影響

PNM 發(fā)酵前后氨基酸和蛋白質(zhì)的變化見(jiàn)表2.PNM 中蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的45.51%，與文獻(xiàn)［18］報(bào)道的38.00%～47.00%相符合;經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌BS H001 發(fā)酵后，F(xiàn)PNM 中蛋白質(zhì)含量升至56.20%，總氨基酸含量由36.38% 升高到42.38%，可見(jiàn)，F(xiàn)PNM 中總蛋白質(zhì)含量和總氨基酸含量分別提高了23.49%和16.49%.在最優(yōu)條件下，PNM 被BS H001發(fā)酵后，非必需氨基酸和必需氨基酸都有一定的增加，其中非必需氨基酸總含量相對(duì)增加了4.92%，丙氨酸、脯氨酸增幅最大，分別為34.72%、26.09%;總必需氨基酸含量相對(duì)增加了43.97%，其中以纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸、蘇氨酸5 種氨基酸的增幅最大，分別為50.00%、544.44%、45.90%、182.22%、69.03%.理想蛋白質(zhì)飲食模式中強(qiáng)調(diào)了必需氨基酸——賴(lài)氨酸含量的重要性，還規(guī)定了賴(lài)氨酸的標(biāo)準(zhǔn)用量［22］;與用豆粕飼喂相比，用在PNM中加入蛋氨酸的飼料飼喂的雞的生長(zhǎng)狀況更好.未發(fā)酵的PNM 中蛋氨酸和賴(lài)氨酸都較缺乏，并且只在足夠蛋氨酸的條件下，賴(lài)氨酸才會(huì)有較好的吸收效果［23］.經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，雖然可以增加PNM 中部分氨基酸的含量，但還是無(wú)法解決其中蛋氨酸和賴(lài)氨酸嚴(yán)重缺乏的問(wèn)題，因此在發(fā)酵PNM 中外加蛋氨酸和賴(lài)氨酸是一個(gè)很好的解決辦法.

表2 發(fā)酵前后PNM 中的氨基酸組成1)Table 2 Composition of amino acids of peanut meal before and after fermentation

3 結(jié)語(yǔ)

枯草芽孢桿菌BS H001 發(fā)酵PNM 的最優(yōu)條件為含水量52%、發(fā)酵時(shí)間44 h、攪拌間隔8 h、滅菌時(shí)間45 min、硫酸銨含量4.0%，在此條件下FPNM 中的蛋白質(zhì)含量為56.20%，比PNM 的提高了23.49%.通過(guò)SDS-PAGE 電泳分析可知，經(jīng)優(yōu)化后第9、13、15、16 組的PNM 中所含的分子質(zhì)量為63、48、41 ku的蛋白質(zhì)大分子被全部降解，F(xiàn)PNM 中非必需氨基酸、必需氨基酸和總氨基酸的含量分別提高了4.92%、43.97%和16.49%.BS H001 還能降解PNM中的黃曲霉毒素(限于篇幅，數(shù)據(jù)未在文中列出).綜上所述，枯草芽孢桿菌BS H001 可用于PNM 的發(fā)酵，發(fā)酵后PNM 的總蛋白質(zhì)、總氨基酸、非必需氨基酸和必需氨基酸的含量均得到了提高，能在一定程度上降低PNM 中蛋白質(zhì)過(guò)敏原的含量，為PNM 的動(dòng)物和人類(lèi)食用可能性提供了依據(jù).在后續(xù)研究中，還將就FPNM 喂飼動(dòng)物時(shí)的消化吸收生物效價(jià)、過(guò)敏反應(yīng)等展開(kāi)探討，并對(duì)枯草芽孢桿菌BS H001 降解PNM 中黃曲霉毒素的降解限量、途徑、關(guān)鍵酶和影響因素等進(jìn)行了解.

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