副溶血性弧菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)研究進(jìn)展

張倩華 (廣西那坡縣疾病預(yù)防控制中心，廣西 坡縣 533900)

副溶血性弧菌是一種嗜鹽性、引起人類(lèi)腸胃炎的革蘭陰性菌，通常棲息于溫暖的海洋或河口環(huán)境中，與貝類(lèi)有共生關(guān)系，帶有毒力基因的菌株嚴(yán)重污染貝類(lèi)［1］。近年來(lái)，由于貿(mào)易全球化，副溶血弧菌引起的食物中毒呈上升趨勢(shì)［2］。因此，早期診斷、及時(shí)預(yù)防和治療是控制該病的關(guān)鍵。副溶血性弧菌實(shí)驗(yàn)室診斷常用的方法有細(xì)菌培養(yǎng)、分離及生化和血清學(xué)鑒定，免疫學(xué)檢測(cè)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。本文將副溶血性弧菌檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展綜述如下。

1 細(xì)菌培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)副溶血性弧菌的傳統(tǒng)方法。國(guó)標(biāo)GB/T 4789.7-2008的檢測(cè)步驟是樣品經(jīng)3%氯化鈉堿性蛋白胨水增菌后轉(zhuǎn)種硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(TCBS)瓊脂或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基，于37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，挑選可疑菌落作生化試驗(yàn)或選用API20E生化鑒定試劑盒或VITEK進(jìn)行鑒定［3］。凌秀梅等［4］按國(guó)標(biāo)采用TCBS瓊脂培養(yǎng)分離結(jié)合傳統(tǒng)生化試驗(yàn)鑒定與科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基結(jié)合API20E生化鑒定作對(duì)比檢測(cè)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基結(jié)合API20E法在檢測(cè)時(shí)間和操作步驟方面要優(yōu)于前者。培養(yǎng)法不需要貴重設(shè)備，基層實(shí)驗(yàn)室都可以開(kāi)展，但操作復(fù)雜、耗時(shí)4～7 d、特異性和敏感性不高。

2 免疫學(xué)檢測(cè)

免疫學(xué)檢測(cè)是根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測(cè)未知的抗體或利用已知的抗體檢測(cè)未知的抗原。血清學(xué)反應(yīng)常用于副溶血性弧菌的血清學(xué)分型鑒定［5］，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)、免疫熒光技術(shù)［6］、免疫印跡［7］等也有學(xué)者應(yīng)用于副溶血性弧菌的檢測(cè)研究。

ELISA法具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，是免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)［8］，其基本原理是酶標(biāo)記抗體與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)，根據(jù)顯色的深淺定性或定量地檢測(cè)樣本中的抗體或抗原。張蕾等［9］制備副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體并建立雙抗夾心ELISA，對(duì)134株副溶血性弧菌和74株非副溶血性弧菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明134株副溶血性弧菌呈陽(yáng)性反應(yīng)，74株非副溶血性弧菌呈陰性反應(yīng)，該方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到l×103CFU/ml菌液，與所測(cè)試的非副溶血性弧菌沒(méi)有交叉反應(yīng)。

3 基因擴(kuò)增技術(shù)

基因擴(kuò)增技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域重要的研究手?jǐn)?，人們已建成了多種方法，其中PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是眾多方法中較為常用于檢測(cè)副溶血性弧菌的方法。研究表明，大多數(shù)副溶血性弧菌對(duì)人類(lèi)不會(huì)致病，僅有少數(shù)攜帶耐熱性溶血毒素(Thermostable direethemolysin，TDH)或TDH相關(guān)溶血毒素(TDH related hemolysin，TRH)或兩者都有的副溶血性弧菌可以引起人類(lèi)疾?。?0］。最簡(jiǎn)單和最常用的診斷副溶血性弧菌是否具有致病性的指標(biāo)是檢測(cè)TDH和TRH基因［2］。此外，不耐熱溶血素基因(tlh)、groEL和 toxR［11-13］基因普遍存在于臨床和環(huán)境中的副溶血性弧菌中，許多研究將其作為檢測(cè)副溶血性弧菌菌種特異性基因。

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù):聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增技術(shù)。目前，臨床上用副溶血性弧菌特異性高的毒力基因作為靶基因，常用的PCR有常規(guī)PCR、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-PCR(RAPD-PCR)、PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(PCR-ELISA)、多重PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。

常規(guī)PCR檢測(cè)副溶血性弧菌只需要設(shè)計(jì)一對(duì)相應(yīng)的引物，擴(kuò)增后用凝膠電泳鑒定［14］。RAPD-PCR的引物是隨機(jī)合成或任意選定，長(zhǎng)度一般為9～10個(gè)寡核苷酸［15］。PCRELISA是應(yīng)用生物素標(biāo)記引物，PCR擴(kuò)增時(shí)，其產(chǎn)物結(jié)合到親和素包被的塑料板上，再用地高辛標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交，然后用抗地高辛的酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)。Kumar等［16］針對(duì)具有TRH的副溶血性弧菌純化重組蛋白，制備單克隆抗體4B10，建立夾心PCR-ELISA法用于檢測(cè)海產(chǎn)樣品，結(jié)果靈敏度高且快速。多重PCR是在同一反應(yīng)管中同時(shí)加上兩對(duì)以上的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可對(duì)副溶血性弧菌基因進(jìn)行分型。Hossain等［17］針對(duì)groEL、TDH和TRH基因設(shè)計(jì)引物，建立多重PCR檢測(cè)海產(chǎn)樣本中副溶血性弧菌，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物分別為510 bp、382 bp和171 bp的DNA片段，該方法最低檢出限為200個(gè)DNA/pg。上述常規(guī)PCR、RAPD-PCR、PCR-ELISA和多重PCR等均不能作定量分析，擴(kuò)增后需用凝膠電泳鑒定，操作比較繁瑣，同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物極易受到污染造成假陽(yáng)性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用對(duì)熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。常用于檢測(cè)副溶血性弧菌的熒光物質(zhì)包括熒光探針和熒光染料。Tyagi等［18］采用熒光染料(SYBR Geenl)作熒光基團(tuán)，以副溶血性弧菌TDH基因設(shè)計(jì)引物，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該方法的最低檢出限量為每個(gè)副溶血性弧菌DNA 0.1 pg，R2值＞0.99，連續(xù)三天測(cè)試，其變異系數(shù)范圍是1.2%～4.2%。龔璞等［19］用副溶血性弧菌TDH基因設(shè)計(jì)引物，建立Taq Man-MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)1株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株和44株副溶血性弧菌環(huán)境分離株的循環(huán)域值 (Ct值)均＜35，未增菌樣品的最低檢測(cè)下限為 25 cfu/ml，經(jīng)6 h增菌后的下限菌量為2.5 cfu/ml;同時(shí)檢測(cè)24株志賀菌、20株沙門(mén)菌、14株大腸桿菌、11株金黃色葡萄球菌，Ct值均＞35或無(wú)Ct值;經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)，其Ct值的變異系數(shù)均＜5%。實(shí)時(shí)熒光PCR簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)PCR方法，實(shí)時(shí)檢測(cè)采用完全閉管、熒光探針標(biāo)記特定核酸的方法，避免了污染，并實(shí)現(xiàn)定量分析，準(zhǔn)確性更高。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù):環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是 Notomi等［20］針對(duì)副溶血性弧菌的TDH和TRH基因設(shè)計(jì)引物，開(kāi)發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，于2000年首次報(bào)道。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，該引物由內(nèi)引物對(duì)(正向內(nèi)引物)和向后內(nèi)引物)和外引物對(duì)(向前外引物和向后外引物)組成。內(nèi)引物包含識(shí)別和抗識(shí)別鏈的靶序列，而外引物僅含有抗識(shí)別鏈的靶序列。在LAMP第一步驟中，一條內(nèi)引物啟動(dòng)鏈置換合成，通過(guò)外引物的退火將在同一靶鏈和后續(xù)合成的互補(bǔ)鏈產(chǎn)生的新產(chǎn)物鏈替換。以替換的產(chǎn)物鏈作為模板，通過(guò)第二內(nèi)引物和外引物雜交形成的另一端靶DNA合成莖-環(huán)狀的新鏈結(jié)構(gòu)。第二輪LAMP反應(yīng)以莖-環(huán)狀新鏈作為模板開(kāi)始鏈置合成，產(chǎn)生新的莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度增加兩倍;反應(yīng)繼續(xù)，重復(fù)積累，產(chǎn)物DNA是擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列，擴(kuò)增的最后產(chǎn)物具有不同個(gè)數(shù)莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)。反應(yīng)時(shí)間不到1 h，并產(chǎn)生109拷貝的靶DNA［21］。

目前臨床上有許多學(xué)者進(jìn)行LAMP技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)副溶血性弧菌研究。Yamazaki等［22］根據(jù)副溶血性弧菌TDH基因和TRH亞型基因(trh1、trh2)設(shè)計(jì)特異性引物，該方法將tdh、trh1、trh2基因設(shè)計(jì)成聯(lián)合和單個(gè)檢測(cè)，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。他們建立的LAMP體系具有高度特異性，對(duì)125株副溶血性弧菌、3株霍利斯格里蒙菌及2株攜帶tdh、trh1、trh2基因的擬態(tài)弧菌進(jìn)行檢測(cè)，與用DNA探針和常規(guī)PCR檢測(cè)的結(jié)果一致，對(duì)20株缺乏TDH、trh1和trh2基因的任何一株細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)均為陰性，該方法僅需要27～60 min，簡(jiǎn)單快速。吳家林等［23］針對(duì)副溶血性弧菌不耐熱溶血素(tlh)基因和tdh設(shè)計(jì)兩套引物，建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法，用PCR法作比較，并進(jìn)行了蝦肉模擬樣品和實(shí)際樣品檢測(cè)。結(jié)果環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)特異性和靈敏度高于PCR法，對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度為101cfu/ml，對(duì)蝦肉模擬樣品檢測(cè)靈敏度103cfu/g。而PCR法的靈敏度分別為102cfu/ml和105cfu/g。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在69份實(shí)際樣品中檢測(cè)出11份tlh基因陽(yáng)性，其中2份tdh毒力基因陽(yáng)性。由于副溶血性弧菌的toxR基因編碼序列的內(nèi)膜“系鏈”區(qū)域具有高度特異性，可用于區(qū)分不同的弧菌，Chen S等［24］針對(duì)副溶血性弧菌toxR基因，設(shè)計(jì)了5種引物，建立LAMP核酸擴(kuò)增基因技術(shù)，對(duì)36株副溶血性弧菌和39株其他細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，并用牡蠣作加標(biāo)試驗(yàn)，同時(shí)用toxR-PCR法作對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果toxRLAMP法在每個(gè)純培養(yǎng)反應(yīng)的最低檢出限為47～470個(gè)細(xì)胞，加標(biāo)試驗(yàn)，能夠檢測(cè)出每克牡蠣含1.1×105個(gè)副溶血性弧菌細(xì)胞，敏感性均比toxR-PCR法高100倍，在這兩種純培養(yǎng)和加標(biāo)牡蠣樣品檢測(cè)副溶血性弧菌產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示細(xì)胞數(shù)和熒光或濁度信號(hào)之間呈良好的線性關(guān)系。

LAMP具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程，在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴(lài)任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，也不需要昴貴的儀器設(shè)備即可開(kāi)展，目前已應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和食品安全的檢測(cè)［25］。

目前，臨床上檢測(cè)副溶血性弧菌的常用方法仍為細(xì)菌培養(yǎng)法，因其所需設(shè)備要求不高，已在基層實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不能做到早期診斷。免疫學(xué)方法因其靈敏性和特異性尚不理想，而且試盒成本高，目前還不為臨床廣泛接受。DNA探針?lè)ㄙM(fèi)時(shí)且操作繁雜。常規(guī)PCR分析雖然提供了快速檢測(cè)，但需瓊脂糖凝膠電泳，也耗時(shí)、繁瑣。近年來(lái)興起的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)比常規(guī)PCR檢測(cè)更快速，但需要昂貴的設(shè)備，檢測(cè)費(fèi)用高，限制其在基層實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。最近發(fā)展起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可作一步法基因擴(kuò)增進(jìn)行簡(jiǎn)單的濁度分析，不需要高度精確和昂貴的設(shè)備，只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫水浴箱即可開(kāi)展工作，比PCR法檢測(cè)更快，更容易執(zhí)行。隨著LAMP技術(shù)的不斷完善，在副溶血性弧菌診斷上將具有良好的應(yīng)用前景。

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