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    超聲波輔助酶解鯰魚肉制備抗氧化肽及其活性評定

    2014-12-16 08:08:54王忠合王曉麗
    食品工業(yè)科技 2014年21期
    關(guān)鍵詞:鯰魚水浴多肽

    王 軍,王忠合,王曉麗

    (韓山師范學(xué)院生物系,廣東潮州521041)

    蛋白質(zhì)經(jīng)水解制得的肽類具有更好的溶解性、功能性和營養(yǎng)性,肽類比氨基酸更易通過小腸黏膜被人體吸收利用,且許多肽類具有不同的生物活性,如抗氧化、降血壓、抑菌、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等[1-2]。一直以來,生物活性肽主要是從植物種子中純化得到,但隨著海洋中豐富的生物資源逐漸為人類所熟知,海洋肽類的開發(fā)和活性研究日益受到關(guān)注,且由于魚蛋白量大而質(zhì)優(yōu),有著巨大的開發(fā)潛力,是人類蛋白質(zhì)的良好來源。鯰魚的肉質(zhì)細(xì)嫩,產(chǎn)量大,含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)素,最近的研究[3-4]發(fā)現(xiàn)鯰魚的魚皮或魚骨中的膠原蛋白是制備活性肽的優(yōu)質(zhì)資源,可大大提高其附加值。目前已有酶解鯰魚加工副產(chǎn)物制備抗氧化肽和抑菌肽等生物活性肽的報道,但是有關(guān)酶解鯰魚肉制備抗氧化肽方面的報道較少,因而深入開發(fā)這一優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源具有較好的發(fā)展前景。

    超聲波具有波動與能量的雙重屬性,作為一種新型的非熱處理技術(shù),具有提取效率高、時間短、副反應(yīng)少等優(yōu)點,廣泛用于食品組分的乳化、均質(zhì)、提取、結(jié)晶、殺菌、脫氣等領(lǐng)域[5-6]。酶法水解蛋白質(zhì)可在一定條件下進(jìn)行定位水解產(chǎn)生特定的肽,易于控制水解進(jìn)程,且具有高度專一性,一般不會導(dǎo)致營養(yǎng)方面的損失,也不會產(chǎn)生毒理上的問題[7];而且酶作用可在溫和條件下進(jìn)行、能耗低,能較好地滿足肽的生產(chǎn)需要。研究表明,超聲波處理可強(qiáng)化提取過程和加速反應(yīng),并可影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、疏水性、絮凝性等[8-9]。因此深入分析超聲處理對蛋白質(zhì)酶解過程及酶解產(chǎn)物活性的影響,為活性肽的制備提供一定的依據(jù),同時對于尋找新型高效天然抗氧化劑及深入開發(fā)淡水魚資源也具有重要的理論和實際意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    鮮活鯰魚 購于當(dāng)?shù)厥袌觯诒羞\(yùn)送至實驗室,去頭、尾、皮、骨及內(nèi)臟,沖洗去血后于絞肉機(jī)中攪成肉糜,裝袋后置于-20℃冰箱中凍藏,備用。

    2,4,6-三硝基苯磺酸 TNBS,美國Sigma公司;2-硫代巴比妥酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶4000U/g 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;胃蛋白酶3000~3500NFU/mg 生工生物工程(上海)有限公司;堿性蛋白酶2.4U/g 諾維信公司;三氯乙酸,NaOH等試劑均為國產(chǎn)分析純。

    KQ-500DV型超聲細(xì)胞破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司;TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LGJ-18型冷凍干燥箱北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;PHS-3D型精密pH計 上海恒磁電子科技有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 鯰魚肉蛋白的酶解工藝 超聲輔助酶法處理:取5g碎魚肉,加入100mL去離子水,用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,于超聲功率為300W,溫度為40℃下超聲處理,超聲處理條件為:工作4s、間歇2s、最高溫度50℃,采用冰水浴進(jìn)行控溫,處理20min后,再加入0.5%(以魚肉計)的胰蛋白酶,置于40℃的恒溫水浴中酶解2h,所得產(chǎn)物滅酶(90℃、15min),經(jīng)10000r/min離心5min,取上清液,冷凍干燥,備用。

    水浴酶法處理:將超聲處理20min用40℃水浴處理代替,其他操作同超聲處理,所得產(chǎn)物滅酶(90℃、15min),經(jīng) 10000r/min離心 5min,取上清液,冷凍干燥,備用。

    超聲酶解處理:加入0.5%(以魚肉計)的胰蛋白酶,其他操作同超聲處理,經(jīng)超聲波預(yù)處理20min后,置于40℃的恒溫水浴中酶解2h,所得產(chǎn)物滅酶(90℃、15min),經(jīng) 10000r/min離心 5min,取上清液,冷凍干燥,備用。

    1.2.2 水解度的測定 水解度的測定采用TNBS法[10],取50μL 酶解液加入 0.5mL 0.2125mol/L 的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH8.2)和0.5mL 0.05%TNBS溶液,混勻,置于50℃下溫浴1h。加入1mL 0.1mol/L鹽酸終止反應(yīng),室溫下放置30min后于420nm處測定吸光度值。另取一定量的樣品放入水解管中,加入100倍體積的6mol/L鹽酸,充氮保護(hù),于120℃下水解24h,冷卻后定容測定總氨基酸的量。以L-亮氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照下式計算水解度(DH):

    式中:At-酶解后氨基酸的量,mg;A0-酶解前氨基酸的量,mg;Amax-氨基酸的總量,mg。

    1.2.3 多肽得率的測定 氨基氮含量采用甲醛電位滴定法[11]測定,按照下式計算多肽得率:

    式中,V1和V2分別為樣品稀釋液及空白組加入甲醛后所消耗氫氧化鈉溶液體積(mL);m為樣品質(zhì)量,g;c為氫氧化鈉溶液濃度(mol/L);0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mmol),K為稀釋倍數(shù)。

    1.2.4 單因素實驗

    1.2.4.1 固液比的影響 選擇固液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 和 1∶40(w/v),其他條件同超聲輔助法酶解處理,酶解后測定多肽得率。

    1.2.4.2 超聲波功率的影響 選定固液比為1∶15,選擇超聲功率分別為 200、250、300、350、400W,其他條件同上,酶解后測定多肽得率。

    1.2.4.3 超聲處理溫度的影響 選定超聲波處理功率為300W,其他條件不變,超聲處理溫度為30、40、50、60、70℃,酶解后測定多肽得率。

    1.2.4.4 超聲時間的影響 在超聲溫度為40℃,超聲功率為300W的條件下,分別超聲波10、20、30、40和50min,酶解后測定多肽得率。

    1.2.4.5 酶解時間的影響 選擇超聲處理的條件后,研究酶解時間為1、2、3、4和5h對肽得率的影響,酶解后測定多肽得率。

    1.2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化實驗 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,選擇顯著影響肽得率的4個因素:超聲時間、超聲功率、超聲溫度、酶解時間,按表1進(jìn)行四因素五水平的響應(yīng)面分析,以肽得率為響應(yīng)變量,優(yōu)化鯰魚肉酶解制備多肽的工藝條件。

    表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

    1.2.6 抗氧化性評定

    1.2.6.1 抗脂質(zhì)過氧化能力分析 新鮮卵黃用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)按1∶1配成懸液,再稀釋25倍,磁力攪拌30min。向試管中加入卵黃懸液0.4mL,再分別加入樣品液0.2mL(冷凍干燥后的樣品用PBS配制,對照組加入同體積的PBS)、25mmol/L的硫酸亞鐵0.4mL,并用0.1mol/L PBS補(bǔ)至4.0mL,置于37℃水浴中,反應(yīng)50min。取出后加入20%三氯乙酸1mL,靜置10min后,以3000r/min離心15min,取上清液4mL加入0.8%硫代巴比妥酸2mL,塞緊試管,于100℃水浴中反應(yīng)15min,空白管以PBS取代上清液,其余操作相同。最后在532nm處測定吸光度,計算抑制率[12]。

    1.2.6.2 清除DPPH自由基能力分析 取不同濃度的多肽樣液2mL于10mL比色管中,分別加入2mL DPPH溶液(1mmol/L,溶于無水乙醇),混勻后在室溫下避光反應(yīng)30min,取出在波長517nm處測定吸光值A(chǔ)S;對照組為2mL無水乙醇溶液代替DPPH溶液與2mL樣液混合測定吸光值為AS;空白組為2mL DPPH溶液與2mL蒸餾水混合測定吸光值為AB;以無水乙醇作為空白調(diào)零。按照下式[13]計算自由基的清除率P:

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD表示,用SPSS 17.0進(jìn)行一維方差分析(one-way ANOVA),差異顯著性采用Duncan(鄧肯)檢驗,檢驗水平p<0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 制備方法對鯰魚肉多肽的影響

    從圖1可以看出,水浴法酶解、超聲酶解法和超聲輔助酶解3種處理方法顯著影響多肽得率(p<0.05),且兩種超聲波處理法的多肽得率和水解度均大于水浴處理法的,而兩種超聲波處理間無差異。與水浴酶解處理相比,超聲波處理能破壞蛋白的結(jié)構(gòu),使酶的結(jié)合位點增多,進(jìn)而提高酶解速率[5,14]。超聲酶解法處理中可能由于超聲波作用破壞部分酶的分子結(jié)構(gòu),從而降低了酶的活性,進(jìn)而降低蛋白酶的酶解速率,影響鯰魚肉蛋白的水解度和多肽得率。因此,后續(xù)實驗選擇超聲輔助酶解法處理鯰魚肉制備抗氧化肽。

    圖1 處理方法對多肽得率的影響Fig.1 Effect of treatment methods on yields of peptieds

    2.2 單因素實驗

    2.2.1 固液比的影響 實驗結(jié)果如圖2。

    從圖2可知,隨著固液比的增加,肽得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,這是因為在反應(yīng)體系中水分含量升高,魚肉蛋白充分分散,有利于超聲波作用并可擴(kuò)大蛋白質(zhì)分子與酶接觸的面積,提高水解度,從而提高肽得率;在高固形物含量條件下酶分子與底物分子的擴(kuò)散性較小,酶分子主要進(jìn)攻蛋白質(zhì)分子表面,形成較多的短鏈肽和長鏈肽[15]。但隨著固液比的繼續(xù)增加,反應(yīng)體系中的水分含量增大,酶與蛋白質(zhì)分子接觸面積增加,蛋白質(zhì)被水解成中等分子量的片段較多,從而影響肽得率,且過多的水分含量也不利于節(jié)省能源,因此本文后續(xù)實驗選取固液比為1∶15。

    圖2 固液比對肽得率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on yield of peptides

    2.2.2 超聲功率的影響 實驗結(jié)果見圖3所示。

    圖3 超聲功率對肽得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on yield of peptides

    由圖3可以看出,在超聲波功率為300W時肽得率最高,而繼續(xù)增大超聲波功率肽得率反而減小,這可能是由于超聲功率過大會破壞酶分子構(gòu)象,使酶活力下降。本實驗選取超聲處理功率為300W。

    2.2.3 超聲溫度的影響 實驗結(jié)果如圖4所示。

    圖4 超聲溫度對肽得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on yield of peptides

    由圖4可以看出,隨著超聲處理溫度的升高,肽得率先增大后減小,超聲作用的最佳溫度為40℃。超聲波作為一種能量形式,具有加熱作用和空化作用,對酶可產(chǎn)生促進(jìn)或抑制雙重作用。當(dāng)溫度較低時,與空化作用相比,加熱作用占主導(dǎo),體系吸收超聲波能量,從而加速酶促水解的反應(yīng),從而提高肽得率。隨著溫度的升高,空化作用所產(chǎn)生的自由基進(jìn)入酶活性中心,破壞酶分子的構(gòu)象。因此,當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時,一方面酶蛋白熱變性,另一方面可能是自由基的破壞作用,導(dǎo)致肽得率下降。因此,本實驗選取超聲處理溫度為40℃。

    2.2.4 超聲時間的影響 實驗結(jié)果如圖5所示。

    圖5 超聲時間對肽得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on yield of peptides

    從圖5可以看出,隨著超聲處理時間的延長,肽得率逐漸提高,當(dāng)處理時間增加到40min時,肽得率達(dá)到最大值(0.7%),而繼續(xù)延長處理時間肽得率下降。這是因為在處理時間較短的條件下,樣品受超聲波的空化作用,擊碎魚肉組織細(xì)胞使蛋白質(zhì)游離出來,而且能夠使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性部位暴露出來,更好的與酶作用[9],從而提高了肽得率。因此,選取超聲波處理的最佳時間為40min。

    2.2.5 酶解時間的影響 實驗結(jié)果如圖6。

    圖6 酶解時間對肽得率的影響Fig.6 Effect of holding time on yield of peptides

    從圖6可以看出,肽得率隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,超過4h后增加的趨勢趨于平緩,這可能是由于隨著酶解時間的延長,魚肉蛋白被酶解成多肽和氨基酸等分子量更小的物質(zhì),長時間的深度水解可能影響多肽的活性[16],因此,后續(xù)實驗選取最佳的酶解時間為2h。

    2.3 工藝條件優(yōu)化

    表2列出了回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計實驗結(jié)果。

    利用Statistica 8.0軟件,對表2中的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項擬合,獲得鯰魚多肽得率對超聲時間、超聲溫度、超聲功率和酶解時間的多元回歸方程:

    式中:y為多肽的得率,z1~z4分別為上述四個自變量的編碼值。

    表2 響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 2 Results of response surface test

    從該方程的方差分析表3可以看出,本實驗所選用模型極顯著(p<0.01),線性相關(guān)系數(shù)R2=0.97,具有較好的相關(guān)性,且失擬項不顯著(p>0.05),擬合度較好,在實驗范圍內(nèi)可以用方程對實驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

    表3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計模型方差分析表Table 3 Analysis of variance table of results

    上述方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗表明:因素z3、z4對鯰魚肉酶解液中多肽得率的線性效應(yīng)顯著,而z1、z2對其影響不顯著;z22、z32、z42對鯰魚肉酶解液中多肽得率的曲面效應(yīng)顯著,z12對其曲面效應(yīng)不顯著;而交互效應(yīng)影響不顯著,如表4所示。

    利用正則分析[17],可求得穩(wěn)定點 Z0=[0.2316,-0.0095,0.4358,1.3341],即:在 X1為 42.32、X2為39.91、X3為321.79、X4為3.33時,酶解液中多肽得率達(dá)到最大值1.08。根據(jù)實際生產(chǎn)情況,可將超聲時間(X1)42min、超聲溫度(X2)40℃、超聲功率(X3)320W、酶解時間(X4)3.3h作為制備的最佳工藝參數(shù),經(jīng)實驗驗證酶解液中多肽得率為1.13%。

    表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Significant test of regression equation

    2.4 抗氧化活性分析

    2.4.1 抗脂質(zhì)過氧化能力 脂質(zhì)過氧化物是生物膜和亞細(xì)胞膜中磷脂質(zhì)所含多元不飽和脂肪酸被自由基氧化形成的過氧化產(chǎn)物,它可引起膜損傷、蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA和RNA結(jié)構(gòu)破壞等生化毒性反應(yīng),造成機(jī)體衰老和多種疾?。?8]。通過對卵黃脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的二級分解產(chǎn)物丙二醛(MDA)的抑制以達(dá)到延緩衰老和防止疾病的作用,結(jié)果如圖7所示。

    圖7 活性肽的抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.7 Anti-lipid peroxidation ability of biopeptide

    由圖7可知,在實驗濃度范圍內(nèi),隨著肽濃度的增加,其抗脂質(zhì)過氧化能力逐漸增強(qiáng),IC50值為0.55mg/mL,由此證明上述酶解法制備的多肽對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的丙二醛具有較好的抑制作用。

    2.4.2 清除DPPH自由基能力 DPPH是一種有機(jī)自由基,清除DPPH自由基目前被作為評價物質(zhì)是否具有抗氧化能力的指標(biāo)之一,不同濃度的活性肽對DPPH自由基清除能力的實驗結(jié)果如圖8所示。

    從圖8可以看出,隨著活性肽濃度的增加,其清除DPPH自由基的能力增強(qiáng),兩者呈正相關(guān)關(guān)系,其IC50值為 0.69mg/mL。

    3 結(jié)論

    3.1 通過響應(yīng)面法得到魚肉蛋白超聲輔助酶法制備抗氧化肽的最佳工藝參數(shù)為:超聲時間42min、超聲

    圖8 活性肽清除DPPH自由基能力Fig.8 DPPH-scavenging capacity of peptides

    3.2 活性肽的抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基實驗結(jié)果表明,鯰魚肉蛋白酶解物具有較好的抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基能力。

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