影響尿液儲存穩(wěn)定性的常見因素

羅 伊，王從容

(上海市糖尿病研究所上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科上海市糖尿病重點實驗室上海市糖尿病臨床醫(yī)學中心代謝性疾病樣本庫，上海 200233)

尿液檢驗因其獲取簡便、收集無創(chuàng)和可提供大量生理變化發(fā)展進程的信息，被臨床廣泛運用。尿液中存在許多潛在的生物標記物，包括代謝物質(zhì)、細胞、蛋白、核酸等。這些生物標記物在檢測藥品的安全性、監(jiān)測急慢性腎臟疾病和其他泌尿道的生理情況上具有突出的作用。為了發(fā)現(xiàn)新的生物標記物以及分析這些生物標記物的特異性和靈敏度，除了依靠高精密的現(xiàn)代化儀器和技術(shù)(蛋白組學、多肽組學、脂質(zhì)組學、代謝組學)，高質(zhì)量的樣本更是必不可少。因此，建立高質(zhì)量的尿液標本保存體系是開展代謝性疾病、腫瘤等重大疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究的重要環(huán)節(jié)。然而，溫度、酸堿度等許多因素對尿液中的生物標記物產(chǎn)生一定的影響。我們主要綜述了外界因素對尿液檢測指標的影響情況及環(huán)境因素對尿液代謝組和蛋白質(zhì)組學分析的影響情況。

一、未添加防腐劑情況下的尿液存儲穩(wěn)定性

有報道[1]指出，通常情況下，尿液的存儲不應當添加任何防腐劑。大量關(guān)于尿液中生物標記物存儲穩(wěn)定性的研究報道都對無防腐劑添加的尿液進行了實驗研究。結(jié)果表明:不同溫度條件下，各種尿液檢測指標的穩(wěn)定性有所差異。

臨床常見的尿液檢測指標有尿肌酐(creatinine，Cr)、尿酸(uric acid，UA)、白蛋白(albumin，Alb)、總蛋白(total protein，TP)、尿鉀(K+)等。大量文獻聚焦于對尿Cr、Alb存儲穩(wěn)定性的研究。尿Cr是臨床重要檢測指標。Cr存儲的穩(wěn)定性較好，在4℃或25℃環(huán)境下，將 Cr存放30 d，仍能保持穩(wěn)定，在55℃環(huán)境下2 d內(nèi)能保持穩(wěn)定[2]。但Cr存儲的穩(wěn)定性會受到pH值變化的影響。當pH值在0.5～7范圍內(nèi)時，室溫或是4℃條件下存放尿液1周，Cr量都沒有顯著變化;當pH=10時，無論是室溫或是4℃條件下，Cr值都有降低[3]。Cr在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性是否優(yōu)于堿性環(huán)境還有待于進一步研究。尿Alb是另一個與腎臟、心血管、糖尿病并發(fā)癥等疾病相關(guān)的檢測指標。在4℃或是20℃條件下若要保持尿液中的Alb濃度無顯著變化，存儲天數(shù)相對較短，最長只能存放1周[4]。另有許多蛋白質(zhì)會受存儲條件的影響，如半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，Cys C)、腎損傷分子-1(kidney injury molecule1，KIM-1)、中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白 (neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)等。Cys C是一種低相對分子質(zhì)量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑[5]。當Cys C/Cr比率在正常范圍時，尿Cys C濃度對于評價腎小球濾過率有重要價值[6]。Cys C作為常規(guī)的生化參數(shù)，在大多數(shù)存儲條件下能保持穩(wěn)定[6-8]。室溫下48 h內(nèi)Cys C可以保持穩(wěn)定，4℃條件下1周內(nèi)保持穩(wěn)定[9]。KIM-1作為尿液中的生物標記物對于早期腎損傷診斷具有重要意義[10-11]。當KIM-1儲存于4℃或室溫下，24 h內(nèi)不會造成明顯降解[12-13]。NGAL在腎損傷的早期診斷中也具有重要意義[14-15]。4℃環(huán)境下儲存7 d，蛋白濃度的改變＜2%[16]。此外，尿糖也是臨床常用的檢測指標。研究表明在4℃條件下24 h內(nèi)尿糖能保持穩(wěn)定[17]。綜上所述，室溫或是4℃條件下尿液不宜存放過久。

相較于室溫或是4℃條件下的存儲，尿液中多數(shù)生物標記物在低溫凍存狀態(tài)下能保持更長久的穩(wěn)定。在-20℃冰凍狀態(tài)下，Cr在6個月內(nèi)可保持穩(wěn)定[18]，KIM-1存儲12周也不會發(fā)生明顯降解[12-13]，尿 Cys C 在 1 周內(nèi)能保持穩(wěn)定[9]，尿 κ輕鏈、尿λ輕鏈、血清類黏蛋白的量24個月內(nèi)沒有顯著的改變[19]。轉(zhuǎn)鐵蛋白、α1微球蛋白在-20℃存放4周后濃度開始有明顯變化[20]。但NGAL在-20℃存儲時，其濃度會產(chǎn)生明顯變化[16]。此外，Alb在-20℃條件下存儲的穩(wěn)定性仍是一個有爭議的問題。一方面有多個報道指出:在-20℃條件下，Alb能長期保持穩(wěn)定。如Innanen[21]等指出尿液存儲在 -20℃條件下3周，融化后離心前進行震蕩(倒置3～4下)，則尿微量白蛋白(microalbumin，mAlb)濃度與凍存前保持一致。還有一些研究表明尿液在-20℃凍存1、2 及 1、2、4、5、6 個月，Alb 濃度前后差異無統(tǒng)計學意義(P ＞ 0.05)[4，22-24]。另一方面有研究證實:在-20℃條件下，Alb不能保持長期的穩(wěn)定性。尿液在-20℃環(huán)境下存放(161 d、2個月、6個月、12個月或 2年)，Alb濃度顯著下降[23，25-27]。此外，不同樣品和相對蛋白濃度，其穩(wěn)定性也有一定差異。在-20℃環(huán)境下存儲尿液6個月后，Alb濃度高的尿液其Alb下降率比Alb濃度低的尿液要低[27]。當 Alb﹤30 μg/min時，-20℃環(huán)境下存放2、8、24周，Alb濃度明顯下降;而Alb＞30 μg/min時，任意儲存溫度、儲存時間都沒有對Alb濃度造成顯著的變化[28]。綜上所述，凍存導致的Alb聚集(可以通過震蕩或是倒置來充分混勻樣品，恢復其原狀)在一定程度上是造成觀測結(jié)果不同的原因所在。是否聚集的Alb會對溶液中的低豐度蛋白起到一個“下沉”的作用，并不可逆轉(zhuǎn)地降低其濃度，至今還沒有定論。Alb存儲穩(wěn)定性也會受到pH值的影響。存儲前調(diào)節(jié)pH值＞8.0，在-20℃條件下，1年內(nèi)Alb濃度無明顯下降[29]。相反，若在尿液中添加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.3～2.5時，會導致室溫下尿Alb迅速降解[30]?？梢娔蛞褐蠥lb的降解具有時間及pH值依賴性。此外，Cys C、KIM-1的穩(wěn)定性也受到pH值的影響。在pH=5或是更高的情況下，尿液中的Cys C能保持穩(wěn)定;雖然pH=4時，Cys C濃度會下降，但若6 h內(nèi)將pH值回調(diào)到≥5時，其濃度會回升[9]。當pH值接近中性(6～8)時，KIM-1能保持穩(wěn)定;當pH值呈酸性或堿性時(4、5、9)時，KIM-1 不再保持穩(wěn)定[31]。但pH 值對尿液電解質(zhì)的穩(wěn)定性影響較小。尿液的酸化或是堿化并不改變尿中鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)的量[32]。即時測定24 h尿液中的Ca2+、Mg2+、PO43-并不需要添加酸性或是堿性物質(zhì)[33]。考慮到pH值對尿液中多種蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，在尿液存儲前應當注意其pH值的大小。

相比尿液存放于-20℃條件下的研究報道，-80℃環(huán)境下尿液存放的穩(wěn)定性研究結(jié)論比較一致。如 Graziani等[26]、Lambers Heerspink 等[29]檢測尿樣在-80℃環(huán)境下保存12個月的變化情況，發(fā)現(xiàn) Alb濃度沒有顯著變化。KIM-1于-80℃儲存達2年也不會對其造成明顯降解[12-13]。Cr在-70℃的冰凍狀態(tài)下2年內(nèi)可保持穩(wěn)定[18，34]。NGAL在 -75 ℃存儲13個月濃度變化不顯著[16]。綜上所述，若想長期保存尿液，更適合將其置于深低溫狀態(tài)下(-70℃或是更冷的溫度)。不僅由于眾多研究表明尿液于深低溫狀態(tài)下凍存時其中的多數(shù)生物標記物的濃度變化相對較小，更有報道指出尿液于-20℃凍存后溶解與于-80℃凍存后溶解相比，凍融引起的物質(zhì)含量下降更為顯著[13]。但尿液中生物標記物也并非都會受凍融的影響造成大幅度地降解。Cys C反復凍融3次后測定其含量為凍融前的97.5%[9]。尿液(正常 Alb尿)凍存于 -30 ℃，室溫溶解，反復凍融5次不會對尿Alb/Cr比率造成影響[35]。正常人或是糖尿病患者(糖尿病患者分為3類:分別為正常Alb尿患者、mAlb患者、Alb尿患者)尿液凍存在-20℃環(huán)境下6周反復凍融6次沒有對Alb濃度造成明顯影響[4]。關(guān)于Alb凍融的穩(wěn)定性也有持相反意見的報道。Vangelisti等[25]發(fā)現(xiàn)反復凍融尿液會導致Alb濃度進行性下降，特別是存儲5個月之后濃度變化更為明顯?？偠灾?，為了檢測或是研究的準確性，在臨床工作還是醫(yī)學生物研究過程中都應盡量避免反復凍融樣品，即時檢測其濃度。若需多次使用樣品可以將其進行分裝，以減少凍融次數(shù)。

近年來，隨著組學技術(shù)的發(fā)展，利用尿液開展代謝組和蛋白質(zhì)組學分析已日益增多。眾多研究利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析反復凍融是否會造成蛋白質(zhì)譜的改變。Papale等[36]運用表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜來觀察室溫下尿液蛋白質(zhì)譜的變化情況。結(jié)果顯示使用蛋白酶抑制劑復合物可增加其穩(wěn)定性;并且蛋白質(zhì)譜在凍融前后有微小差異，但增加凍融次數(shù)(≤5次)并沒有進一步影響蛋白質(zhì)譜的改變。Fiedler等[37]使用磁珠來分離尿液中的尿肽然后使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間技術(shù)來描述多肽組的特征，觀察到凍融1次后尿液和新鮮尿液間蛋白質(zhì)譜有顯著改變，但增加凍融次數(shù)(3次內(nèi))不會對蛋白質(zhì)表達譜造成進一步的改變。另有研究[38]則發(fā)現(xiàn)尿蛋白在凍融4次后還能保持穩(wěn)定;而凍融第5次后這些蛋白就無法被檢測出來?？梢?，反復凍融會對尿液蛋白質(zhì)譜的檢測造成一定影響。

Saude等[39]使用核磁共振氫譜來分析尿液中代謝物質(zhì)的變化情況。研究結(jié)果表明將女性尿液于室溫下存放4周，若在存儲前將其離心可以降低其中代謝物質(zhì)的變化程度;若在存儲前過濾尿樣也可以降低其中代謝物質(zhì)的變化程度，但相比存儲前離心的尿液其產(chǎn)生的變化程度更大。Erik等[39]將女性尿液在室溫下存放4周，觀察苯酸鹽和乳酸鹽濃度在原尿和過濾后的尿液中的變化情況。結(jié)果顯示原尿中苯酸鹽和乳酸鹽濃度在第一周顯著升高，在之后的3周升高緩慢;而在過濾后的尿液中苯酸鹽和乳酸鹽濃度在4周內(nèi)沒有明顯變化。可以看出尿液存儲前的預處理對于尿液存儲過程中的代謝物質(zhì)變化有顯著影響。而關(guān)于存儲條件對尿液中代謝物質(zhì)的變化情況的研究則表明尿液(男性尿液、女性尿液)于室溫下存放4周，其中的代謝物質(zhì)有顯著變化;4℃條件下存放4周，代謝物質(zhì)濃度有輕微降低。

二、添加不同防腐劑后尿液存儲穩(wěn)定性

乙二胺四乙酸(EDTA)和亞硫酸氫鈉是常用的尿液采集防腐劑。防腐劑的種類因測試方法、保存時間及樣本運輸條件的不同而不同[40]。當需要保存尿液中的尿膽素原時，需要添加福爾馬林;但在測定葡萄糖濃度時不能使用福爾馬林，因其會干擾定性的化學檢測。檢測葡萄糖時可以使用氟化鈉作為防腐劑，因為其可以阻止糖酵解的發(fā)生?？梢姡栏瘎τ谀蛞旱某Ｒ姍z測指標會產(chǎn)生一定的影響，許多研究也證實了這一現(xiàn)象。將尿液存放于室溫下6 h后可以明顯觀察到加入疊氮化鈉后的抑菌效果[41]。尿液中細菌的繁殖會導致多種生物標記物的降解。將尿液于室溫下存放4周，若添加防腐劑疊氮化鈉，隨著濃度的增加(0.1、1、10 mmol/L)，代謝物變化程度變小[39]。Tencer等[19]指出:IgG、HC 蛋白在 -20 ℃ 凍存時，加入防腐劑(溶液中包括氯化物、EDTA、三羥甲基氨基甲烷、疊氮化物)能夠阻止其降解。-20℃凍存條件下，IgG存儲1周后濃度開始下降[20，42]，但加入葡萄糖和牛血清白蛋白后可阻止 IgG 含量的下降[42]。有文獻[43]顯示，在尿 Alb正?；蚴怯衜Alb尿存在的胰島素依賴型糖尿病患者中，尿中含有葡萄糖的樣本其IgG/Alb指數(shù)高于無葡萄糖含量的樣本。推測葡萄糖可能有抑制IgG降解的作用。樣本中加入300 mmol/L葡萄糖可抑制尿液中IgG濃度的下降(如同時加入牛血清Alb則更佳)。防腐劑的添加會影響尿液存儲的穩(wěn)定性，在選擇防腐劑時應考慮到檢測物質(zhì)的種類、保存時間等因素。

三、結(jié)語

總之，在尿液儲存過程中，有些生物標記物易受存儲條件的影響，而有一些分子可以保持較長時間穩(wěn)定。小分子物質(zhì)、代謝物質(zhì)和一些大分子物質(zhì)之間的穩(wěn)定性是有區(qū)別的。不同生物標記物的降解率是不同的，而且很難通過生物標記物的分子大小進行預測。尿液中生物標記物受到各種外在因素的影響，但對一些指標仍存在爭議，仍有必要開展尿液貯存穩(wěn)定性的系列研究。

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