RP-HPLC-熒光法測(cè)定大鼠海馬組織中5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)

白 鈺，張 莉，馬曉麗，孔 彬，李新霞，李新宇

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011;2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002;3.新疆醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心，新疆 烏魯木齊 830011;4.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括興奮性氨基酸[如谷氨酸(glutamate，Glu)、天門(mén)冬氨酸(aspartate，Asp)]和抑制性氨基酸[如甘氨酸(glycine，Gly)]兩大類。這些神經(jīng)遞質(zhì)主要分布于哺乳動(dòng)物的腦組織中，起著維護(hù)腦內(nèi)正常生理功能的關(guān)鍵作用[1]。因此，定量測(cè)定腦組織中這些氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的含量對(duì)研究神經(jīng)系統(tǒng)生理[2]、腦血管病具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，生物樣品中的氨基酸含量測(cè)定多采用高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜和毛細(xì)管電泳等[3-4]。柱前衍生HPLC法由于其高度的選擇性和快速性成為藥物和臨床樣品中氨基酸分析的首選方法。目前，常用的衍生試劑主要有鄰苯二甲醛(OPA)[5]、異硫氰酸酯(PITC)[6]、丹磺酰氯(DNS-Cl)[7]等，6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺氨基甲酸酯(AQC)是Waters公司開(kāi)發(fā)出的一種專利氨基酸衍生試劑，具有快速、高效、穩(wěn)定的衍生特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品中氨基酸含量的監(jiān)測(cè)，但對(duì)生物樣本中氨基酸的檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道。

由于腦內(nèi)氨基酸含量較低，因此我們采用AQC這種新型熒光衍生試劑，運(yùn)用柱前衍生反相(reverse phase，RP)-HPLC-熒光法測(cè)定正常大鼠海馬組織中5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。

材料和方法

一、儀器與試劑

WATERS e2695型高效液相色譜儀(包括UV-2489紫外檢測(cè)器、2475熒光檢測(cè)器)，SUPELCOSIL LC-18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，Sigma公司)，Empower 3 色譜工作站;BS 110S型分析天平(Sartorius公司，d=0.1 mg);SK-1型快速混勻器(金壇市醫(yī)藥儀器廠);PB-10型pH計(jì)(Sartorius公司);溶劑過(guò)濾裝置;MULTIFUGE X3R型離心機(jī)(Thermo公司);DK-S22型水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)有限公司).

氨基酸[Asp、Glu、天冬酰胺(Aspa)、谷胺酰胺(Gln)、Gly]對(duì)照品購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度均＞98%。

AccQ·Fluor氨基酸衍生試劑盒(美國(guó)Waters公司，包括AQC粉末2A、2B和硼酸鹽緩沖液)，乙腈和甲醇為色譜純;超純水由milli-Q超低有機(jī)物超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)制備，其他試劑均為分析純。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，體重250～280 g，雌雄不拘，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(醫(yī)動(dòng)字第16-003號(hào))。

三、色譜條件

流動(dòng)相A:準(zhǔn)確稱取7.4 g無(wú)水乙酸鈉，加水930 mL，溶解后用冰醋酸調(diào) pH 值至6.5，然后加乙腈70 mL，混勻，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相B:甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20。柱溫:37℃;熒光檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)235 nm，發(fā)射波長(zhǎng)395 nm;流速:1.0 mL/min，進(jìn)樣量 5 μL。線性梯度洗脫:0 min，0%B;5 min，2%B;10 min，5%B;12 min，0%B;20 min，100%B。

四、溶液配制

1.對(duì)照品溶液配制 精密稱取5種氨基酸對(duì)照品各約10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L HCl稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為1 mg/mL的氨基酸儲(chǔ)備溶液，4℃冰箱放置。精密吸取各儲(chǔ)備液適量置同一10 mL容量瓶中，用超純水稀釋并定容，混勻作為工作液，依次逐級(jí)稀釋配制系列濃度工作液，按照上述色譜條件進(jìn)樣。

2.衍生試劑的配制 精密量取1 mL AccQ·Fluor 2B試劑加入裝有AccQ·Fluor衍生劑粉末的2A瓶中，加蓋密封，旋渦震蕩10 s，55℃水浴加熱10 min，直至AccQ·Fluor衍生劑粉末全部溶解，即得濃度為10 mmol/L衍生化試劑，置干燥器中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

五、氨基酸對(duì)照品的衍生化反應(yīng)

精密量取混合氨基酸對(duì)照品10 μL，置于進(jìn)樣襯管中，加入硼酸緩沖液70 μL和配制好的AQC試劑10 μL，在渦旋振蕩器上混勻，室溫放置1 min轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶，水浴加熱55℃ 10 min，直接進(jìn)樣5 μL進(jìn)行色譜分析。AQC與氨基酸反應(yīng)的方程式見(jiàn)圖1。

圖1 AQC與氨基酸反應(yīng)方程式

六、大鼠海馬組織預(yù)處理及衍生化反應(yīng)

分別取大鼠腦海馬，稱濕重，以甲醇∶水(V/V)=1∶1的比例加入1 mL，冰浴下充分勻漿;勻漿液在4℃下13000×g低溫離心15 min，取上清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。精密吸取上清液10 μL，按照氨基酸對(duì)照品的衍生化反應(yīng)步驟進(jìn)行衍生化反應(yīng)，進(jìn)樣5 μL色譜分析。

結(jié) 果

一、氨基酸對(duì)照品及大鼠海馬組織的HPLC圖譜

混合氨基酸對(duì)照品溶液和海馬組織樣品中5種氨基酸的分離譜圖見(jiàn)圖2。15 min內(nèi)各氨基酸均得到完全、有效的分離，峰形良好，無(wú)重合、拖尾等現(xiàn)象。

二、線性范圍和檢測(cè)限

檢測(cè)配制好的系列濃度混合氨基酸對(duì)照品溶液，以氨基酸峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，按信噪比(S/N)=3計(jì)算各氨基酸的檢測(cè)限。5種氨基酸的峰面積和濃度之間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為 0.99990 ～0.99997，見(jiàn)表1。

三、精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取已知濃度的氨基酸混合對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果表明5種氨基酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 0.4% ～2.5%，重現(xiàn)性良好。

圖2 混合氨基酸對(duì)照品和大鼠海馬組織的HPLC圖譜

取已知濃度的混合氨基酸對(duì)照品衍生化后于第0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣分析，測(cè)得5 種氨基酸衍生物色譜峰峰面積的RSD為0.7% ～3.8%，表明海馬組織經(jīng)AQC衍生化后至少在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

取混合海馬組織樣品作為質(zhì)控(QC)樣品，分別加入已知濃度的混合氨基酸對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算方法的回收率。5種氨基酸的加標(biāo)回收率為70.27% ～128.20%，RSD 均 ＜5%，表明本法能準(zhǔn)確測(cè)定樣品中多種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。見(jiàn)表2。

表1 氨基酸的線性范圍及檢測(cè)限

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

三、樣品分析

分別用建立的氨基酸衍生方法測(cè)定8只正常大鼠海馬組織中的5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算各種氨基酸的含量。結(jié)果顯示大鼠海馬組織中 Asp、Glu、Aspa、Gln、Gly 的含量分別為 38.98 ± 9.66、126.42 ± 34.06、2.16 ±0.75、90.44 ±33.75、(12.95 ±4.42)μg/g。

討 論

本研究建立了適用于大鼠海馬組織中5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的RP-HPLC-熒光檢測(cè)方法。在探索該樣品測(cè)定方法時(shí)，主要考察了海馬樣品提取方法[8]，分別選用生理鹽水、甲醇、甲醇/水進(jìn)行提取，高氯酸除蛋白后進(jìn)行衍生反應(yīng)。經(jīng)過(guò)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)直接用1∶1的甲醇/水既可以達(dá)到提取作用，又可以同時(shí)除去組織中蛋白質(zhì)，提取回收率達(dá)到80%以上。因此樣品制備最終選擇直接用等比例的甲醇/水處理后直接衍生化反應(yīng)進(jìn)樣分析。

在衍生試劑選擇上，本研究沒(méi)有選用文獻(xiàn)常用的OPA[8-12]。因?yàn)镺PA需要衍生后快速進(jìn)樣，且衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，在1.5 min后會(huì)快速降解，存在重復(fù)性差等情況。因此，本研究選用新的熒光衍生試劑AQC，采用梯度洗脫同時(shí)測(cè)定大鼠海馬組織中5種神經(jīng)遞質(zhì)的含量。方法學(xué)研究證明AQC衍生樣品后在12 h內(nèi)均符合穩(wěn)定性要求，且該方法對(duì)樣品預(yù)處理及測(cè)定有操作簡(jiǎn)單、靈敏、色譜峰分離效果極佳、分離時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，僅需12 min便能完成5種遞質(zhì)的完全分離。綜合這些特點(diǎn)說(shuō)明AQC優(yōu)于以往常用的OPA，適合腦內(nèi)微量神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定。

在回收率測(cè)定中，由于本研究未選用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行樣本萃取回收的實(shí)驗(yàn)，而是利用外標(biāo)法直接進(jìn)行定量測(cè)定，可能會(huì)存在一定誤差，希望在以后的試驗(yàn)中進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究采用AQC衍生，RP-HPLC結(jié)合熒光檢測(cè)法對(duì)氨基酸進(jìn)行分離檢測(cè)。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示該法靈敏度高，重現(xiàn)性好，方法簡(jiǎn)便、快速，可以為海馬組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的分析檢測(cè)提供一種新手段，并為廣大醫(yī)務(wù)及科研工作者在臨床監(jiān)測(cè)及科研方面提供參考。

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