一株縮合單寧降解菌的篩選、鑒定及降解效果分析

陳度宇, 王 森, 張 宇, 許 雷

中國農業(yè)科學院研究生院, 北京 100081

植物單寧，又稱植物鞣質(vegetable tannin)，是植物體內產生的，能使生皮成革的復雜多酚。它是植物的次生代謝產物，屬于天然有機化合物。Freudenberg根據(jù)其化學結構特征首次將其分為水解單寧(hydrolysable tannin)及縮合單寧[1]?？s合單寧也稱原花青素，是以無分支黃酮類化合物為主的聚合物，其母核結構為黃烷醇，分子中的芳香環(huán)以C-C鍵連接，其分子骨架為C6-C3-C6，在水溶液中不容易發(fā)生分解，而大部分縮合單寧在熱強酸的作用下能產生花色素，故而這類化合物又被稱為原花色素[2]。植物單寧分布廣泛但利用率很低，而縮合單寧作為其中一種重要的天然可再生資源，如何提升其利用率一直是研究的目的所在?？s合單寧的分子量和聚合度大小對其化學特性和生物活性具有顯著的影響。含縮合單寧的植物飼料如高粱等具有抗營養(yǎng)作用，即一種被認為是由多種因素綜合影響動物對植物的消化與吸收的作用。

落葉松樹皮、葡萄皮及成熟的深色高粱籽皮富含原花青素類縮合單寧，且結構單元為兒茶素。兒茶素是最重要的一類黃烷-3-醇化合物，化學結構為5,7,3′,4′-四羥基黃烷-3-醇，除研究較多的(+)-兒茶素外還有3種立體異構體[(-)-兒茶素、(+)-表兒茶素、(-)-表兒茶素]。兒茶素的生物活性和應用價值都比縮合單寧更佳，更容易被動物體吸收利用，一些研究認為兒茶素具有的強抗氧化活性可以清除人體自由基，延緩衰老；作為黃酮類物質，它還具有一定的預防心血管疾病和癌癥的作用；并且在降低血壓、血糖、血脂方面有一定的作用，對控制中心性肥胖也有一定效果。研究者們根據(jù)植物體中原花青素由黃烷醇單體縮合而成的合成途徑逆向推斷出縮合單寧的優(yōu)勢降解產物為兒茶素[3]，因此有效降解縮合單寧對提升其應用價值很有意義，而且可以為進一步研究如何提高含單寧植物飼料的營養(yǎng)價值和探索單寧在醫(yī)藥、食品、化妝品等精細化學品領域應用提供研究基礎。

單寧的降解主要有兩種方法：化學降解和生物降解，目前縮合單寧的解聚主要依靠化學手段，但顯然不如生物降解環(huán)保、安全、成本低、易操控。所以分離出能有效降解縮合單寧為兒茶素的微生物菌株十分有意義。早在1867年，Vantieghem就發(fā)現(xiàn)了1株青霉(Penicilliumglaucum)能夠將五倍子中的單寧降解為沒食子酸[4]。Bhat等綜述了目前常見的單寧降解菌發(fā)現(xiàn),具有單寧降解能力的微生物大多是霉菌,其中又以青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)種類居多[5]。1999年，McSweeney等首次報道了以縮合單寧為單一碳源的瘤胃細菌[6～8]。羅欣[9]利用黑曲霉將茶多酚多聚體降解為兒茶素單體進行了研究，并對降解條件進行了優(yōu)化，實驗中發(fā)現(xiàn)黑曲霉對茶多酚多聚體具有良好的降解效果；劉繼偉[10]進行了青霉菌降解沙棘籽原花青素的研究，優(yōu)化了降解條件并對降解機理做了較深入的探討；蘭平等[11]選取青霉和米曲霉進行了葡萄皮單寧的降解研究，研究了不同的降解工藝參數(shù)對降解效果的影響?？s合單寧降解菌株的篩選鑒定研究可以為證明縮合單寧生物降解可行性提供可靠依據(jù)，同時為進一步研究縮合單寧降解酶打下基礎，有助于最終實現(xiàn)工業(yè)化降解縮合單寧生產兒茶素，提高縮合單寧利用率，十分符合資源節(jié)約環(huán)境友好型社會的發(fā)展要求。

1 材料與方法

1.1 材料來源

縮合單寧材料選用落葉松單寧(聚原花青素>95%)購自北京百奧科利有限公司，經正丁醇鹽酸顯色法檢測所購落葉松單寧溶液顏色變紅，證明所購材料為縮合單寧，通過香草醛法繪制的質量濃度和物質的量濃度標準曲線，再根據(jù)公式計算得到樣品縮合單寧的聚合度是3，即說明購買的落葉松單寧主要成分為三聚體縮合單寧。

標準品兒茶素[(+)-catechin，色譜純，Sigma公司]，原花青素標準品(proanthocyanidins B1色譜純，Sigma公司)。

菌源為中國農業(yè)科學院飼料所南口養(yǎng)殖基地牛羊圈新鮮糞土。

1.2 培養(yǎng)基配制

馴化培養(yǎng)基：NaNO32 g/L，K2HPO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，121℃高壓滅菌20 min，加入制霉菌素5 mg/100 mL，放線菌酮2 mg/100 mL，加入落葉松單寧(濾滅溶液)濃度從0.1 g/L一直提高到2 g/L。

篩選培養(yǎng)基：NaNO32 g/L，K2HPO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂1.8 g/L， 121℃高壓滅菌20 min，加入適量落葉松單寧濾滅液。

LB平板(LB固體培養(yǎng)基)：蛋白胨1 g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 1 g/L。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品縮合單寧的檢測及其聚合度的鑒定 用正丁醇-鹽酸顯色法[12]：在0.5 mL所購落葉松單寧配置的一定濃度的水溶液中加入5 mL正丁醇(含5%HCl)95℃水浴2 h后觀察顏色變化,用紫外分光光度計(Thermo公司，美國)測定550 nm處吸光度建立標準曲線用于計算縮合單寧濃度。

香草醛法[13]：用甲醇和乙酸分別配制系列濃度(25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、300 mg/L)的兒茶素標準品和濃度為100 mg/L的落葉松單寧樣品，用香草醛-甲醇法(2 mL樣品+5 mL 1%香草醛-甲醇溶液+5 mL 20%硫酸甲醇，室溫避光反應15 min，紫外分光光度計500 nm處檢測吸光度)分別測甲醇配制的標準品和樣品，根據(jù)標準品的結果繪制質量濃度標準曲線計算樣品的質量濃度m(g/L)，而香草醛-乙酸法(2 mL乙酸配制的樣品+5 mL 0.5%香草醛-甲醇溶液+5 mL 10%硫酸甲醇，室溫避光反應5 min，紫外分光光度計500 nm處檢測吸光度)則用于測定繪制物質的量濃度標準曲線以計算樣品的物質的量濃度n(mol/L)，最后根據(jù)公式DP=m/(n×M)計算出平均聚合度，其中M為兒茶素分子質量290.27。

1.3.2馴化培養(yǎng)與分離篩選 取適量糞土樣品于250 mL錐形瓶中加入無菌生理鹽水100 mL，30℃震蕩培養(yǎng)7 d，然后靜置，取部分上清液加入馴化培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)7 d，然后靜置，取上清加入單寧濃度稍大的培養(yǎng)基中，按此步驟重復操作逐步提高培養(yǎng)基中單寧濃度至5 g/L。

將富集馴化的培養(yǎng)液梯度稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)，觀察長菌情況，挑出有降解圈的單菌落，在LB平板上重復劃線分離純化后4℃密封保存。利用Biolog對菌株進行生理生化測試初步鑒定菌種。

1.3.3菌種鑒定 利用16S rRNA基因測序比對對菌株進行菌屬鑒定：將篩選出的菌株用LB液體培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng)過夜，用于基因組提取。用TaKaRa基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA基因的通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)PCR擴增菌株的16S rRNA基因片段。PCR程序為：95℃預變性5 min; 95℃ 變性35 s，50℃ 退火30 s，72℃ 延伸90 s ，35個循環(huán); 72℃延伸5 min。引物的合成和PCR產物的測序由寶生物工程(大連)有限公司完成。將得到的測序結果在NCBI網站進行Blast，分析比對結果，構建系統(tǒng)發(fā)育樹確定菌屬。

1.3.4菌B1生長曲線的測定 分離出單菌落分別接種于加入和未加入縮合單寧的LB培養(yǎng)基中，30℃ 160 r/min震蕩培養(yǎng)，收集36 h內不同時間點菌液用紫外可見分光光度計測OD值(OD600)，繪制生長曲線。

1.3.5液相色譜法測定菌液中成分的變化 液相色譜法：樣品經0.22 μm的孔徑無菌濾膜過濾后，使用Agilent 1200 高效液相色譜儀(Agilent公司，美國)，方法為：色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)，流動相:乙腈:0.5%磷酸水(V/V)=85∶15，上樣量2 μL，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，利用二極管陣列復合波長檢測器進行檢測，檢測波長為280 nm。利用液相色譜法建立原花青素和兒茶素的標準曲線，每隔12 h收集一次培養(yǎng)液過濾后檢測計算其中成分的變化情況。

1.3.6不同碳源和氮源對菌株生長的比較試驗 以篩選培養(yǎng)基為基礎，2種外加碳源培養(yǎng)基分別添加0.2 g/L的葡萄糖和蔗糖，兩種外加氮源培養(yǎng)基則在以不添加NaNO3的篩選培養(yǎng)基為基礎，分別添加牛肉膏和蛋白胨，4種培養(yǎng)基各接入1%菌液，30℃ 160 r/min搖床培養(yǎng)，每隔12 h取1瓶菌液樣品經0.22 nm無菌濾膜過濾后液相色譜法(同1.2.6)測定計算菌液中縮合單寧的降解率，分析不同碳源和氮源對縮合單寧降解情況的影響。

降解率=(對照樣品中濃度-處理樣品中殘留濃度)/對照樣品中濃度×100%

1.4 數(shù)據(jù)結果分析

使用Origin 8和Microsoft Excel 2010分析處理數(shù)據(jù)，繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1菌株的馴化篩選和Biolog測定 因為縮合單寧有一定的抑菌性，糞土樣品中的多數(shù)菌并不能生長，所以含較高濃度縮合單寧的篩菌培養(yǎng)基平板上很難長出菌，菌B1由于能利用縮合單寧，故能在平板上長出并有降解圈現(xiàn)象，肉眼觀察其菌落為白色規(guī)則平滑圓點，顯微鏡下觀察到是一種運動活躍的短桿細菌，通過Biolog試驗對菌B1進行生理生化鑒定，一些基本特性結果如表1所示，鑒定結果顯示菌B1可能為腸桿菌屬(Enterbacter)。

表1 菌株B1 生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain B1．

2.1.2菌株16S rRNA 基因序列鑒定 菌株B1的16S rRNA基因序列在NCBI上比對分析的結果表明，菌株B1的16S rRNA 基因序列與多株Enterobactersp.的序列相似度為99%，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹( 圖2所示) ，菌株B1 (圖2)與Enterobacterxiangfangensis10-17T聚為一支，故斷定菌株B1 為腸桿菌(Enterobactersp．)。經Biolog試驗分析和16S rRNA基因測序比對均證實菌B1為腸桿菌(Enterobactersp．)。

2.2 菌B1生長曲線

如圖3所示，菌株B1在LB 液體培養(yǎng)基中生長較快，約3 h可進入對數(shù)生長期直至24 h 后進入平臺生長期，最大OD600值2.5左右。在加入縮合單寧的培養(yǎng)基中，菌B1生長則受到明顯抑制，生長達到平臺期所花時間明顯延長，9 h才進入生長期，且最大OD600值小于2.5,略低于未加入縮合單寧的培養(yǎng)基中的值(圖3)。但是總體生長趨勢上菌B1受到的影響并不大，由此看出菌B1對縮合單寧表現(xiàn)出較好的抵抗能力，這也是菌B1能降解縮合單寧的重要前提。

圖2 基于16S rRNA基因序列同源性的B1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of B1 and related stains.注:節(jié)點值是1 000次重復抽樣分析的支持百分率。

圖3 菌株B1生長曲線Fig.3 The growth curve of strain B1.

2.3 菌B1對縮合單寧的降解情況

縮合單寧在降解過程中，先由聚合體解聚為單體，單體可以被微生物利用，所以在檢測縮合單寧降解情況過程中通常以原花青素和兒茶素的變化作指示。結合圖4和圖5，可以推斷菌株B1對縮合單寧具有降解作用。

圖4是紫外分光光度法測定發(fā)酵液中縮合單寧變化從而繪制得到的菌B1縮合單寧降解率曲線，從圖中可以看到，降解率在72 h達到93.46%，在84 h之后由于正丁醇鹽酸反應不變紅且吸光值很小故推測已經不含縮合單寧，即降解率為100%。

圖5是液相色譜法測定菌B1發(fā)酵液中原花青素和兒茶素隨時間的變化量。從圖中可以看到菌液中原花青素含量隨時間降低明顯，空白對照(未接菌的培養(yǎng)基)中原花青素降低不明顯，從0 h開始原花青素含量急劇減少，36 h后減勢趨于平緩，72 h時空白對照組與實驗組中原花青素含量差別最大，推測此時縮合單寧降解達到最大值， 72 h后原花青素濃度小于5 mg/L；相比之下兒茶素從12 h后開始生成，濃度不斷升高，48 h后上升趨勢逐漸減慢趨于平緩，生成的兒茶素最大濃度約20 mg/L，而在空白樣中檢測到的兒茶素濃度幾乎可以忽略不計。

2.4 外加碳源和氮源對縮合單寧降解的影響

從圖6可以看到菌B1在4種外加碳/氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中對縮合單寧的降解情況，加葡萄糖的培養(yǎng)基中縮合單寧的降解率在20%上下波動，這說明在能夠以葡萄糖為碳源時明顯看出菌B1對縮合單寧降解率低且無明顯規(guī)律，在加蔗糖的培養(yǎng)基中，36 h前縮合單寧的含量不降反增，說明添加蔗糖的培養(yǎng)基不能加速促進菌B1對縮合單寧的降解，36 h后降解率才逐步上升，此時表明菌B1開始降解縮合單寧；而加入蛋白胨和牛肉膏的培養(yǎng)基中縮合單寧降解率都呈上升趨勢，尤其是加入牛肉膏的培養(yǎng)基中，36 h后都基本檢測不到縮合單寧，故認為此時降解率為100%。對比無外加碳氮源隨時間逐漸增大，36 h后變化緩慢，60 h和72 h時都為88%，可以看出外加牛肉膏氮源更利于菌B1對縮合單寧的降解。

圖4 菌B1發(fā)酵過程中縮合單寧降解率Fig.4 Degradation ratio of condensed tannins in fermentation by strain B1.

圖5 菌B1發(fā)酵過程中原花青素和兒茶素濃度Fig.5 Concentration of procyanidins B1 and (+)-catechin in fermentation process by strain B1.

圖6 縮合單寧降解率變化情況Fig.6 Changes of condensed tannins degradation rate.

總而言之，外加碳源使菌B1不需要降解縮合單寧來維持生長，故縮合單寧降解延后或無明顯規(guī)律；而氮源的不同則使菌B1降解能力出現(xiàn)差異，牛肉膏明顯更有助于菌B1對縮合單寧的降解。

3 討論

國內外關于單寧降解的研究不少，但多集中于對水解單寧的降解研究，縮合單寧降解菌的研究很少且多為霉菌。本實驗馴化篩選到了一株能以縮合單寧為單一碳源生長的細菌B1，經鑒定為一株腸桿菌(Enterobactersp.)，經比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建發(fā)現(xiàn)其與香坊腸桿菌聚為一支，相似度最高。菌B1對縮合單寧的抑菌性有抵抗力，在含縮合單寧的培養(yǎng)基中細胞生長趨勢受影響小，菌株表現(xiàn)出較好的縮合單寧降解能力，無論是正丁醇鹽酸法還是HPLC，檢測結果都表明菌B1對縮合單寧的降解率高達90%以上。來自腸道菌群的菌B1馴化后所表現(xiàn)出的強縮合單寧降解能力對消除飼料的抗營養(yǎng)作用、增強動物對含單寧飼料的吸收都有應用意義。而且，菌B1能將縮合單寧解聚為兒茶素從而有效利用縮合單寧生長，利用液相色譜檢測到菌B1在3 d內便通過降解縮合單寧生成約20 mg/L的兒茶素。這是研究縮合單寧為生物降解中首次獲得的能有效將縮合單寧降解為兒茶素的細菌，這也為黃酮類物質的獲得開辟了新路徑，且細菌從細胞結構上比霉菌更便于研究，可以方便進一步挖掘微生物降解縮合單寧的關鍵基因與作用酶，可以以此進一步驗證單寧降解菌的降解機制和降解途徑，從而大大加快縮合單寧降解為兒茶素的工業(yè)化應用的實現(xiàn)，提高縮合單寧的降解率，為下一步研究縮合單寧降解酶和相關基因作準備，也可以為進一步探索細菌對縮合單寧的降解過程提供實驗基礎。研究后續(xù)將構建菌B1的基因組文庫，篩選驗證降解的關鍵基因，進一步探究縮合單寧降解的機理。