南藥益智SRAP-PCR體系優(yōu)化及引物篩選

歐虹雅, 韓冬苗, 黃茲寶, 張明康, 周聰聰, 高炳淼

海南醫(yī)學院藥學院, ?？?571199

益智(AlpiniaoxyphyllaMiquel)為姜科山姜屬植物，其果實為常用中藥益智仁，味辛、性溫，具有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功效[1,2]。野生益智主要生長于雨量充足、氣候濕潤的山坡林地。目前，益智的種植方式主要為人工栽培，常種植于海南島各山區(qū)或人工橡膠林下，此外，在廣東、廣西、云南、福建等地也有少量的種植[3]。益智的化學成分主要為萜類、黃酮類、二苯基庚烷類、酚類、甾醇類等，其中，倍半萜類、二苯基庚烷類是其重要活性成分[4～6]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，益智具有抗癌、強心、舒張血管、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗過敏、抗衰老、抗氧化、提高免疫力、保護神經(jīng)細胞等多方面的藥理活性[7～9]。

海南島地處中國最南端，位于熱帶和亞熱帶，擁有獨特的氣候和地理環(huán)境，藥用植物資源豐富。全島已知的藥用植物資源達3 100種以上，其中，1 000多種被《全國中草藥匯編》收錄，135種載入《中國藥典》[10]。近幾年，隨著益智藥食功能的開發(fā)，市場需求量不斷增加，使人們開始無節(jié)制的采挖益智，導致野生益智資源逐年減少。因此，保護南藥益智資源刻不容緩。隨著分子遺傳學的快速發(fā)展，基于PCR技術的各種分子標記技術得到了廣泛應用，并且因其簡單易行、快速準確、重現(xiàn)性好、成本低、抗污染等優(yōu)點，具有十分廣闊的應用前景[11]。序列相關擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)標記技術已被廣泛應用于藥用植物種質(zhì)資源的鑒定、藥用植物的分子機制和遺傳多樣性的研究，并成為被相關研究人員使用的熱門技術之一[12,13]。SRAP標記的優(yōu)點是將擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length olymorphism，AFLP)標記和隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphism DNA，RAPD)標記有機地結(jié)合在一起，具有簡單穩(wěn)定、產(chǎn)量中等、高頻共顯性的優(yōu)勢，同時，該方法與其他方法相比，如RAPD標記、AFLP標記、簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)標記，更能反映表型多樣性和進化歷史，故成為近年來比較流行的分子標記技術之一[13,14]。

本研究以南藥益智為材料，采用L16(45)正交試驗優(yōu)化并建立適用于南藥益智的SRAP-PCR體系，再以優(yōu)化后的SRAP-PCR體系篩選引物，以期為南藥益智的遺傳多樣性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 22份樣品材料均為采集于海南不同地理居群的益智的新鮮葉片，采收后使用硅膠干燥，室溫保存。全部樣品經(jīng)海南醫(yī)學院潘坤副教授鑒定為姜科植物益智。

1.1.2實驗試劑Taq酶、Mg2+、dNTPs、DNA Marker D2000、RNaseA和植物基因組DNA提取試劑盒均來自天根生化科技(北京)有限公司；SRAP引物由深圳華大基因科技有限公司合成；瓊脂糖(Biowest Agarose)購自海南合輝實業(yè)有限公司；核酸染料(Goidview)購自上海賽百盛公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3實驗儀器 WD-9402B型PCR擴增儀(北京六一生物科技有限公司)；HYQ-2110型微型渦旋混勻器(美國精騏有限公司)；DYY-6D型電泳儀電源(北京六一生物科技有限公司)；核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司)；HH-3型恒溫水浴鍋(邦西儀器科技(上海)有限公司)；DYCP-31DN型SDS-電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；SIGMA 1-14微型離心機(德國Sigma公司)；Tanon 4100凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 益智DNA提取及其濃度、純度檢測

將采集的22份益智樣品經(jīng)酒精消毒后，剪碎放入已滅菌的缽體中，添加液氮迅速研磨后，稱取100 mg裝到離心管中，然后根據(jù)植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取其DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度，用核酸蛋白測定儀檢測其純度。

1.3 SRAP-PCR反應體系優(yōu)化

采用L16(45)正交試驗(表1)對Taq酶、dNTPs、Mg2+、引物、DNA模板5個影響因素進行優(yōu)化。然后，隨機挑選1對SRAP引物(引物序列見表2)，以最優(yōu)反應體系進行PCR擴增，反應程序為94℃ 3 min；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，共5個循環(huán)；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 5 min。最后，將PCR產(chǎn)物置于4℃保存。

1.4 SRAP-PCR特異性引物篩選

將合成的正、反向引物(各12條)進行自由組合，得到144對隨機配對引物，利用最優(yōu)SRAP-PCR反應體系從中篩選出擴增效果良好的引物。

表1 正交試驗L16(45)設計表Table 1 The table of orthogonal test L16 (45) design.

表2 SRAP-PCR所用引物Table 2 Primers used in SRAP-PCR.

2 結(jié)果與分析

2.1 益智DNA樣品提取及其濃度、純度檢測

采用植物基因組DNA提取試劑盒提取22份來自海南不同地理居群的益智基因組DNA，提取的DNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1)，DNA條帶均明亮、整齊且未見明顯降解。經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測，A260/A280比值均在1.8～2.0之間，表明RNA和蛋白質(zhì)去除較為完全。結(jié)合電泳鑒定結(jié)果和A260/A280比值可以確定，提取的益智基因組DNA滿足SRAP-PCR對DNA質(zhì)量的要求。

2.2 SRAP-PCR反應體系優(yōu)化

采用正交試驗優(yōu)化SRAP-PCR擴增過程中的各影響因素，以表1中的16個反應體系進行SRAP-PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖2)。正交試驗結(jié)果分析如表3所示，由此得出各因素影響順序：Mg2+>TaqDNA聚合酶>DNA模板=dNTPs>引物，其中，Mg2+以2 mmol/L為佳，TaqDNA聚合酶以0.25 U或0.5 U為佳，DNA模板以10 ng為佳，dNTPs以2 mmol/L最佳，引物以1 μmol/L或4 μmol/L為佳。結(jié)合電泳鑒定結(jié)果，判斷最優(yōu)反應體系為7號，擴增后條帶大小在100～2 000 bp之間，且條帶數(shù)最多。

圖1 益智基因組DNA提取樣品鑒定Fig.1 The electrophoresis result of extracted Alpinia oxyphylla Mique genome DNA samples.

圖2 正交實驗優(yōu)化SRAP-PCR體系Fig.2 The optimization of SRAP-PCR system by orthogonal test.

表3 正交結(jié)果分析Table 3 Analysis of orthogonal results.

因此，最優(yōu)反應體系(總體積為25 μL)為：Taq酶 0.5 U，dNTPs 4 mmol/L，Mg2+2 mmol/L，引物各 2 μmol/L，DNA模板10 ng，10×PCR buffer 2.5 μL。

2.3 引物初篩與多態(tài)性分析

將正、反向引物(各12條)自由組合，得到144對引物，以最優(yōu)反應體系進行PCR擴增，利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物后，獲得24對引物(圖3)。再對初步篩選出的24對引物的多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)率進行分析，由表4可知，總條帶數(shù)為164條，其中多態(tài)性條帶數(shù)為138條，平均總多態(tài)率達84.1%。由24對引物擴增出的總條帶數(shù)最多達11條，最少為4條，平均每對引物的擴增條帶數(shù)為6.83條，平均多態(tài)性條帶數(shù)為5.75條。多態(tài)率在85%以上的引物共有11對：f1r2、f6r12、f8r1、f9r1、f9r10、f9r12、f10r2、f10r10、f10r11、f12r6、f12r11，其中f9r10和f10r11的多態(tài)率為100%。結(jié)合擴增產(chǎn)物多態(tài)性分析和瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，獲得7對適合南藥益智的SRAP-PCR擴增引物，分別為f8r1、f9r1、f9r10、f10r2、f10r10、f10r11、f12r6。最后，以f10r11引物為例對不同地理居群的益智基因組DNA樣品進行SRAP-PCR擴增，結(jié)果表明篩選獲得的引物能夠滿足南藥益智遺傳多樣性的分析需求(圖4)。

圖3 SRAP-PCR引物篩選電泳結(jié)果Fig.3 The electrophoresis result of primers screened by SRAP-PCR.注：M：Marker；1～24：不同引物(與表4中的編號相對應)的SRAP-PCR擴增產(chǎn)物。

表4 SRAP-PCR擴增產(chǎn)物多態(tài)性分析Table 4 The polymorphic analysis of SRAP-PCR amplified products.

圖4 不同地理居群的益智基因組DNA SRAP-PCR鑒定結(jié)果Fig.4 The SRAP-PCR identification result of Alpinia oxyphylla Miquel genomic DNA in different geographical groups.

3 討論

近年來，隨著分子生物學的快速發(fā)展，分子標記技術在植物學研究中得到了廣泛而深入的應用。DNA分子標記技術是建立在藥用植物遺傳物質(zhì)的基礎上，其結(jié)果不受環(huán)境條件、樣品形態(tài)和物質(zhì)來源的影響，可為藥用植物資源的研究提供更準確、可靠的信息[15]。劉曉靜[16]應用簡單重復序列間擴增(inter simple sequence repeat，ISSR)分子標記方法對采自海南和廣東的7個野生益智居群進行遺傳多樣性分析。鄒穎[17]采用SSR標記技術對所采集到的不同地理居群的益智樣品進行了遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和居群親緣關系的研究。高炳淼等[18,19]利用正交設計方法對益智的AFLP-PCR和ITS-PCR的擴增條件進行了優(yōu)化。

SRAP標記是近年來發(fā)展的一種基于PCR的分子標記技術[11]，已在大黃[20]、甘草[21]、人參[22]、石斛[23]等中藥的研究領域得到了廣泛的應用。但是，尚無該技術在益智研究中應用的報道。本試驗緊密結(jié)合海南省南藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的實際情況，針對南藥益智野生資源不斷受到破壞、其栽培品質(zhì)不斷下降等問題進行研究，為野生益智種質(zhì)資源保護、鑒定和評價提供了科學依據(jù)，同時也為海南益智的中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good agricultural practices，GAP)種植基地進行種質(zhì)資源篩選和藥材地道性評價提供了理論基礎。

本研究利用正交試驗優(yōu)化SRAP-PCR反應中的影響因素，從而快速、省時地獲得了最優(yōu)PCR擴增體系，同時避免了單因素試驗不能兼顧各因素間的交互作用的問題。正交實驗結(jié)果表明，TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物、DNA模板等對SRAP-PCR擴增均有一定的影響，其影響順序為Mg2+>TaqDNA聚合酶>DNA模板=dNTPs>引物。首先，Mg2+對益智SRAP-PCR體系的影響最大，高濃度Mg2+易影響酶的活性、擴增的可靠性及特異性，而低濃度Mg2+會影響擴增產(chǎn)量甚至導致無法擴增出條帶。其次，TaqDNA聚合酶的量過低可導致PCR反應不完全，而過高又會增加非特異性產(chǎn)物，所以TaqDNA聚合酶的用量也是關鍵。再者，DNA模板和dNTPs兩者對反應體系的影響程度相當。高濃度dNTPs會導致TaqDNA聚合酶的復制出現(xiàn)錯誤，非特異性產(chǎn)物增多；而低濃度會造成過早用完原料，達不到理想的擴增效果。同樣地,DNA模板濃度過高可導致非特異性產(chǎn)物增多，而濃度過低又會使擴增產(chǎn)物較少。最后，在本研究結(jié)果中，引物濃度對SRAP-PCR反應體系的影響較小。本試驗各因素對反應體系的影響順序與唐古特大黃[20]的研究結(jié)果相似，其與本試驗不同的是引物和dNTPs的影響順序，這可能是DNA模板差異導致的。本研究通過正交實驗得出SRAP-PCR反應擴增的最優(yōu)反應體系(總體積25 μL)：TaqDNA聚合酶0.5 U，dNTPs 4 mmol/L，Mg2+2 mmol/L，引物各2 μmol/L，DNA模板10 ng，10×PCR buffer 2.5 μL。

引物序列是SRAP-PCR擴增過程中的關鍵，即使建立了最優(yōu)PCR擴增體系，倘若引物沒有良好的選擇性和特異性，也無法獲得準確的實驗結(jié)果。因此，在獲得最優(yōu)PCR擴增體系的基礎上，本研究對144對引物進行了大量的篩選工作。從中初步篩選出24對引物，再對這些引物進行SRAP-PCR的多態(tài)性數(shù)據(jù)分析，得出益智總條帶數(shù)為164條，其中多態(tài)性條帶數(shù)達138條，多態(tài)率為84.1%。最后，篩選出7對特異性引物，其擴增產(chǎn)物片段大小均在100～2 000 bp以內(nèi)且分布較均勻，多態(tài)性條帶比率皆達85%以上。

本研究通過正交試驗對SRAP-PCR體系各影響因素進行優(yōu)化，建立了最優(yōu)的適用于南藥益智的SRAP-PCR體系。又利用最佳SRAP-PCR體系對特異性引物進行篩選，獲得7對適用于益智遺傳多樣性分析的引物，為南藥益智的遺傳多樣性研究、品種鑒定、親緣關系分析、遺傳圖譜構(gòu)建等奠定了基礎。