小分子抗體制備技術(shù)及臨床應(yīng)用進(jìn)展

陳麗娟，張麗華，李 杰，陳永新

自20世紀(jì)80年代以來，隨著各種分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和抗體基因結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步闡明，DNA重組技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于抗體的改造，抗體制備技術(shù)已從多克隆抗血清、單克隆抗體發(fā)展到基因工程抗體。隨著近年來各種抗體制備相關(guān)技術(shù)如噬菌體抗體庫技術(shù)、核糖體展示技術(shù)等的不斷發(fā)展，人們可制備各種類型的小分子抗體，如Fab抗體、ScFv抗體、單域抗體等，這些抗體的分子量只有完整抗體的1／6～1／2大小，除具有分子量小，穿透性強(qiáng)，不與Fc受體結(jié)合等特點外，還易于在各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)及便于操作和大量生產(chǎn)，已成為基因工程抗體家族的主要成員和研究熱點。現(xiàn)對小分子抗體的制備技術(shù)及其在臨床醫(yī)學(xué)和疾病診斷治療等領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 小分子抗體的分類

常見的小分子抗體主要包括Fab（由完整的輕鏈和Fd構(gòu)成），F(xiàn)v（由 VH 和 VL 構(gòu)成），ScFv（單鏈抗體，VH 和 VL 之間由一連接肽連接而成），單域抗體（僅由VH組成），最小識別單位（MRU，由一個CDR組成）以及超變區(qū)多肽、雙鏈抗體、三鏈抗體、微型抗體等幾種類型。而目前研究比較多的是單鏈抗體，F(xiàn)ab抗體，單域抗體及雙特異性抗體等。

1．1 單鏈抗體 在DNA水平上用一段適當(dāng)?shù)墓丫酆塑账嶙鳛檫B接肽（linker）將VH和VL連在一起，使之表達(dá)成為一條單一肽鏈，即為單鏈抗體（ScFv）。如ZCH－7－2F9單鏈抗體（ScFv2F9）的構(gòu)建不僅有利于在大腸桿菌中進(jìn)行基因重組操作和表達(dá)也增加了其穩(wěn)定性［1］。但有時構(gòu)建的ScFv其親和力明顯低于親本抗體，并常有聚集的傾向。為改善這一不足，如在構(gòu)建抗狂犬病毒的單鏈抗體ds－FV57時就在VH和VL之間插入了一個鏈間二硫鍵［2］，這個鏈內(nèi)二硫鍵遠(yuǎn)離互補(bǔ)決定區(qū)（CDRS），也不會影響抗原與抗體的結(jié)合能力，所以可以廣泛應(yīng)用，將這一類抗體簡稱為dsFv。單鏈抗體分子量小，對腫瘤的穿透力強(qiáng)，可將其與藥物或同位素、毒素等結(jié)合后在腫瘤的靶向治療中發(fā)揮獨特的優(yōu)勢，在疾病的診斷方面具有一定的價值。

1．2 Fab抗體 Fab抗體由一條完整的輕鏈和重鏈Fd段通過一個鏈間二硫鍵連接組成一個異二聚體，分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，不僅保持了天然抗體分子Fv段的結(jié)構(gòu)，還具有穿透力強(qiáng)、免疫原性低，可與多種藥物及放射性同位素偶聯(lián)，用作藥物的導(dǎo)向治療載體和顯影等特點。目前已用作實驗室研究工具，如構(gòu)建噬菌體Fab抗體庫，鑒定抗體可變區(qū)間基因的功能活性，以及觀察蛋白酶抑制抗體的不同機(jī)制等［3］。在此基礎(chǔ)上，制備的單鏈Fab片段（scFab）可進(jìn)一步加強(qiáng)功能性分子的生成［4］。但Fab抗體因其雙鏈結(jié)構(gòu)在原核細(xì)胞的表達(dá)受到一定的限制，還因蛋白分子在穿過內(nèi)膜和折疊時效率低下，影響其分泌性表達(dá)量，且僅有1個抗原結(jié)合位點，與抗原的親和力低，在腫瘤診斷方面沒有dsFv應(yīng)用廣泛。

1．3 單域抗體 由于發(fā)現(xiàn)有些抗體的VH區(qū)也可與抗原結(jié)合，且保持了完整抗體的特異性，稱其為單域抗體（single domain antibody）。單域抗體只有完整IgG分子的1／12，相較于其他抗體分子量更小也更容易進(jìn)入細(xì)胞。而近幾年隨著抗體制備技術(shù)的不斷發(fā)展，單域抗體不僅在微生物中高表達(dá)，也能保持一定的可溶性和穩(wěn)定性，所以比較適合用噬菌體展示或核糖體展示等技術(shù)制備［5］，而且制備操作簡便，可用來構(gòu)建效應(yīng)功能和結(jié)合親和性的抗體，具有一定的應(yīng)用發(fā)展前景。

1．4 雙特異性抗體（bispecific antibody，BsAb） 雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，一個位點可與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合，另一個位點則可與載荷物如毒素、酶、細(xì)胞因子、放射毒素等耦合，能在靶細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域的熱點，在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景［6，7］。

2 小分子抗體的制備

當(dāng)前，常用于生產(chǎn)小分子抗體片段的表達(dá)系統(tǒng)通常有大腸桿菌（E．coli）表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)4種。它們的表達(dá)成本大致是依次遞增的，但翻譯后加工的精確性和準(zhǔn)確度卻是依次遞減的。因為不同的小分子抗體其一級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物活性是各不相同的，所以在選擇表達(dá)系統(tǒng)時要根據(jù)所要表達(dá)的小分子抗體的類型、性質(zhì)、目的產(chǎn)物的表達(dá)量和純度的要求等來選擇。

2．1 大腸桿菌（E．coli）表達(dá)系統(tǒng) E．coli表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，應(yīng)用比較廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)常用來表達(dá)Fab、ScFv等小分子抗體。E．coli生長速度快培養(yǎng)周期短，目的蛋白表達(dá)水平高，遺傳背景也比較清楚，而且進(jìn)行抗體工程研究時花費較少，所以目前被廣泛使用。但是由于大腸桿菌本身的蛋白翻譯后修飾加工體系相當(dāng)不夠完善，因此在表達(dá)外源蛋白時不能對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行修飾加工，影響了外源蛋白的活性，而且表達(dá)的外源蛋白也容易被宿主菌釋放的蛋白酶降解，所以要選擇合適的宿主菌，這些都限制了其的應(yīng)用［8］。

2．2 酵母表達(dá)系統(tǒng) 酵母表達(dá)系統(tǒng)，既具有微生物的特點，又作為真核生物彌補(bǔ)了原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏蛋白質(zhì)翻譯后加工的缺陷。目前常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)有啤酒酵母（Sacharomyces cervisiae）和巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）等。啤酒酵母安全性高，但表達(dá)的蛋白質(zhì)常超糖基化，分泌能力不強(qiáng)，較難實現(xiàn)高密度發(fā)酵。近年常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)主要是畢赤酵母系統(tǒng)，它具有發(fā)酵密度高，分泌外源產(chǎn)物能力強(qiáng)，能翻譯后修飾和糖基化修飾等優(yōu)勢，迄今為止已經(jīng)成功表達(dá)了幾百種外源蛋白［9］。人們利用畢赤酵母系統(tǒng)成功的從1L酵母培養(yǎng)基上清液中純化得到56mg的人類BAFF scFv－Fc抗體，不但解決了大腸桿菌表達(dá)抗體時不能分泌，復(fù)性后生物活性差以及產(chǎn)率低等缺陷，也消除了細(xì)菌表達(dá)的抗體在臨床應(yīng)用時可能存在毒性的風(fēng)險［10］。但畢赤酵母分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)差，發(fā)酵周期長，發(fā)酵時需添加甲醇都限制了對其的使用。

2．3 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一類廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng)，和大多數(shù)高等真核生物相似具有翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。主要包括桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)兩種。而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外較為推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，主要分成兩大類，一類是用于表達(dá)單個外源基因的載體，另一類是多元表達(dá)載體，用于插入并表達(dá)2個或多個外源基因。應(yīng)用這一系統(tǒng)表達(dá)的產(chǎn)物具有糖基化，磷酸化等修飾，接近于天然蛋白［11］。Furuta等［12］利用桿狀病毒感染夜蛾成功表達(dá)出具有活性的Fab抗體。但是桿狀病毒系統(tǒng)無法進(jìn)行連續(xù)性高表達(dá)，糖基化方式與哺乳動物存在一定差異，其功能基因組學(xué)的研究仍然比較薄弱，有關(guān)病毒晚期的高表達(dá)和調(diào)控機(jī)制等仍不夠明了，所以這些問題都限制了其的應(yīng)用，這還需要我們不斷探索可對其進(jìn)行部分改進(jìn)以達(dá)到理想的效果。

2．4 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 與其他系統(tǒng)相比，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面接近天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。目前常用于表達(dá)蛋白的哺乳動物細(xì)胞宿主有 CHO、COS、HeLa細(xì)胞、HEK293、NSO 等，其中CHO細(xì)胞是近年來研究最多應(yīng)用相對廣泛的細(xì)胞系，可用于表達(dá)多種外源蛋白。有報道利用重組的CHO細(xì)胞表達(dá)外源蛋白時產(chǎn)量能達(dá)到10 g／L，這可用于重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)［13］。另外COS細(xì)胞系可用來做較為快速的測定，非洲綠猴腎的Vero細(xì)胞系可用來生產(chǎn)流感疫苗。所以目的不同選擇表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞也不同，但哺乳動物細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感，營養(yǎng)和生長因子缺乏、缺氧、病毒感染、機(jī)械攪動以及培養(yǎng)壓力的增加等很多因素都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，所以利用該系統(tǒng)表達(dá)時需要大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞，成本較高，而且在篩選過程中比較費時也比較容易污染，這些都限制了其的應(yīng)用，目前已有很多學(xué)者開始關(guān)注哺乳動物細(xì)胞的篩選研究［14］。

3 小分子抗體在臨床上的應(yīng)用

隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，小分子抗體的制備越來越容易，而且小分子抗體的一系列特性決定了其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的許多方面將具有很大的應(yīng)用潛力，主要表現(xiàn)在疾病診斷、腫瘤性疾病治療及抗感染等方面的應(yīng)用。

3．1 在疾病診斷方面的應(yīng)用 隨著抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，放射性標(biāo)記抗體的應(yīng)用越來越廣泛應(yīng)用于腫瘤影像和診斷中。將針對腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗體用放射性核素標(biāo)記后注入人體，隨血液流達(dá)腫瘤組織，與腫瘤的相關(guān)抗原結(jié)合，從而獲得腫瘤的陽性顯像圖稱為放射免疫顯像。而小分子抗體所具有的分子量小，組織穿透強(qiáng)，清楚快等特點決定其更適合應(yīng)用于放射免疫顯像，應(yīng)用于腫瘤的診斷。Douguchi等［15］運用噬菌體展示技術(shù)篩選出與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H889結(jié)合的scFv，不僅可用于小細(xì)胞肺癌的早期診斷，還可以根據(jù)膜定位位置對小細(xì)胞肺癌進(jìn)行影像學(xué)定位，具有很大的臨床價值。而99m锝－標(biāo)記的抗CEA Fab抗體片段應(yīng)用于臨床影像學(xué)定位已經(jīng)通過美國FDA認(rèn)證。目前有些研究可將一些小分子抗體片段制備成某種試劑盒或芯片用于臨床檢測。Matsumoto等［16］通過制備抗觸珠蛋白的Fab抗體檢測試劑盒來檢測胰腺癌，發(fā)現(xiàn)通過此檢測胰腺癌IV期的陽性率顯著高于其他臨床分期。Even－Desrumeaux等［17］還將篩選出的單域抗體制成抗體芯片，Mazzucchelli等［18］利用磁性納米技術(shù)將重組單域蛋白A標(biāo)記，均可用于檢測某些腫瘤標(biāo)志物。

3．2 在腫瘤導(dǎo)向治療中的應(yīng)用 惡性腫瘤的導(dǎo)向治療，是指應(yīng)用親腫瘤特異性載體與殺傷腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)（化療藥物、毒素、放射性核素等）相連接，將活性物質(zhì)選擇性送到腫瘤部位，定向的殺傷腫瘤細(xì)胞的方法。在腫瘤治療中，雙特異性抗體可針對低水平的腫瘤相關(guān)抗原，將活性物質(zhì)選擇性送到腫瘤細(xì)胞。Wang等［19］制備的抗G22×I50雙特異性抗體通過誘導(dǎo)TH1型細(xì)胞因子分泌及激活CD8T細(xì)胞，抑制CD4（＋）CD25（＋）T細(xì)胞的表達(dá)，可探索鼻咽癌中抗癌抗生素免疫機(jī)制。Kellner等［20］制備的抗 CD19×CD16 雙特異性抗體，可增強(qiáng)B淋巴瘤細(xì)胞的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）。Tuscano 等［21］構(gòu)建抗 CD20×CD22 雙特異性抗體可用于治療淋巴細(xì)胞瘤。此外，也可將制備的人源小分子抗體直接用于腫瘤的診斷治療。

3．3 小分子抗體的抗感染作用 目前人類最常利用疫苗和抗生素來預(yù)防和治療感染性疾病，但對于SARS、AIDS等疾病，目前還未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法，但可選用抗體治療作為首選方案。如Shen等［22］已成功構(gòu)建了針對特異性細(xì)胞株的Fab噬菌體抗體庫。Hartono等［23］則研究比較了HK20Fab和D5Fab分別與HIV－1gp41結(jié)合的親和力以抑制病毒和細(xì)胞膜的結(jié)合，這些對于SARS的預(yù)防、診斷和治療將奠定一定的基礎(chǔ)。對于一些其他的感染性疾病，Chen等［24］制備的Fab091抗體已經(jīng)證實可以中和狂犬病病毒，它可以和單克隆抗體一樣在未來的研究中作為接觸狂病病毒的預(yù)防措施。

此外，小分子抗體還可用作酶標(biāo)抗體、用于臨床診斷和腫瘤影像分析等。將單鏈抗體同酶、蛋白質(zhì)的基因連在一起，構(gòu)建成復(fù)合功能抗體基因，通過成熟表達(dá)和純化技術(shù)直接分離出用于臨床診斷的酶標(biāo)抗體，使診斷更為方便、快速、更適合于臨床應(yīng)用。

4 展 望

近年來，有關(guān)小分子抗體的研究進(jìn)展迅速，在基礎(chǔ)理論研究和臨床應(yīng)用方面都取得了一定的效果。目前通過基因工程抗體技術(shù)制備的小分子抗體在疾病診斷、腫瘤性疾病治療、抗感染以及放射顯像等方面均得到了廣泛的應(yīng)用。但是，制備的小分子抗體在產(chǎn)量、親和性、穩(wěn)定性等方面尚未達(dá)到臨床應(yīng)用的要求，抗體的免疫原性仍然是臨床治療的主要障礙，如何得到足夠數(shù)量及質(zhì)量的小分子抗體在技術(shù)上仍是一個未解決的問題。因此，如何提高其表達(dá)產(chǎn)量，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和特異性，提高臨床應(yīng)用的有效性及可靠性，仍需做大量深入的研究和臨床試驗。相信隨著抗體技術(shù)的不斷發(fā)展和基礎(chǔ)研究的不斷深入，小分子抗體在臨床疾病診治中的應(yīng)用將會更廣泛。

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