外源性及內(nèi)源性細(xì)胞凋亡機(jī)制研究進(jìn)展

生理情況下，個體發(fā)育過程中出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞數(shù)量及出現(xiàn)凋亡的時間固定，這是一種主動的程序性細(xì)胞死亡過程。秀麗線蟲有1090 個體細(xì)胞，其發(fā)育過程中有131 個體細(xì)胞在特定的時間點發(fā)生凋亡。Horvitz 等以秀麗線蟲ced-1 和ced-2 的突變體作為研究對象，篩檢與凋亡啟動或調(diào)解有關(guān)的基因，并于1986 年首次報道了兩個與凋亡有關(guān)的突變基因ced-3 和ced-4［1］;6 年后，ced-9 被發(fā)現(xiàn);隨后哺乳動物中相應(yīng)的同源蛋白被發(fā)現(xiàn)，如與ced-9 同源的Bcl-2，與egl-1 同源的BH3-only 蛋白，ced-4 則與哺乳動物的銜接蛋白凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease-activating factor 1，apaf-1)同源［2］。目前，已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了兩條主要的細(xì)胞凋亡途徑［3］，本文就其具體分子機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 參與細(xì)胞凋亡的蛋白分子

1.1 BCL-2 家族的結(jié)構(gòu)、分類及功能 迄今發(fā)現(xiàn)BCL-2 家族約有20 個家庭成員;根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可將其分為三類:①BCL-2 亞家族，具有抗凋亡作用，包括BCL-2、BCL-w、BCL-xL、A1、MCL-1 等。常位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)膜(如線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面、核膜)，通過與家族中促凋亡成員結(jié)合行使抗凋亡功能。它們的結(jié)構(gòu)中含有BH1 ～BH4 四個結(jié)構(gòu)域。②BAX 亞家族，這類蛋白具有促凋亡作用，包括BAK 和BAX，結(jié)構(gòu)中含有BH1 ～BH3 三個結(jié)構(gòu)域。在凋亡過程中通過同源聚集，在線粒體外膜上形成微孔通道，增加其通透性，細(xì)胞色素C (CytochromeC，CytC)與凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等蛋白分子經(jīng)該通道從線粒體內(nèi)外膜間隙溢出到細(xì)胞質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實驗證實，即使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微量注射CytC 亦能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］;BAX與BAK 在凋亡過程中扮演重要角色。兩者均敲除后，細(xì)胞便能耐受tBid 及多種線粒體功能、結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。③BH3-Only 亞家族，該組成員只有一個BH3 結(jié)構(gòu)域，根據(jù)功能不同進(jìn)一步細(xì)分為兩個亞群:“BH3-only 凋亡執(zhí)行蛋白”，包括Bid、Bim等;“BH3-only 凋亡感受蛋白”，包括Noxa，Bfm or Bik 等［5］。

BCL-2 家族中促凋亡成員與抗凋亡成員間通過相互作用影響對方功能。促凋亡成員將其BH3 結(jié)構(gòu)域插入抗凋亡成員由BH1、BH2、BH3 結(jié)構(gòu)域形成的疏水凹槽中，形成“異源二聚體”［6］。BH1、BH2、BH4 結(jié)構(gòu)域是抗凋亡所必需的。實驗中發(fā)現(xiàn)，BH3-only 亞家族成員蛋白的BH3 多肽同BH3-only 亞家族成員一樣，能結(jié)合到BCL-2 亞家族成員上，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］，說明BH3 結(jié)構(gòu)域是促凋亡所必需的。通常認(rèn)為，BH3-only 蛋白直接激活BAX/BAK，促使其構(gòu)象改變，形成寡聚體并插入線粒體外膜［5，8］，在其表面打孔，釋放CytC 等凋亡相關(guān)蛋白。

1.2 Caspase 的分類、結(jié)構(gòu)與功能。

1.2.1 分類 Caspase 屬于半胱氨酸蛋白酶家族成員，直接參與并執(zhí)行凋亡程序。目前在人類中已發(fā)現(xiàn)11 種caspase:caspase1 ～10 和caspase14，而caspase11 ～13 僅存在于牛、老鼠等其他哺乳動物中。根據(jù)功能不同可將caspase 分為與凋亡相關(guān)性caspase 和與炎癥相關(guān)性caspase［9］。前者包括起始caspase:caspase-2，-8，-9，-10 和 效 應(yīng) caspases:caspase-3，-6，-7。與 炎 癥 相 關(guān) 的 caspase 包 括caspase-1，-4，-5，-11，-12，-13。另外，在脊椎動物中caspase-15，-16，-17，-18 相繼被發(fā)現(xiàn)，但它們的功能尚不明確［10］。

1.2.2 結(jié)構(gòu) caspase 由一個前端結(jié)構(gòu)域(亦稱N端多肽區(qū))一個大亞基、一個小亞基及大、小亞基之間的連接區(qū)(又叫活化環(huán))組成;后三者構(gòu)成caspase的催化區(qū)。相比其它caspase，效應(yīng)caspases-3，-6，-7的前端結(jié)構(gòu)域較短。較長的前結(jié)構(gòu)域在蛋白與蛋白的相互作用中行使功能，如caspases-2 的前端結(jié)構(gòu)域又稱caspase 募集區(qū)(caspase recruitment domain，CARD)，caspases-8，-10 的前端結(jié)構(gòu)域含有死亡效應(yīng)區(qū)(death effector domain，DED)重復(fù)序列;CARD 和DED 均擁有一個6 螺旋束結(jié)構(gòu)，在調(diào)節(jié)信號復(fù)合體形成過程中起重要作用［11］。

1.2.3 活化、成熟過程 caspase 在細(xì)胞中以無活性的酶原形式(procaspase)存在。其活化包括同源活化和異源活化兩條途徑。同源活化需要將procaspase 募集到細(xì)胞內(nèi)特定分子上，如procaspase-8，-10 被募集到死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(death-inducing signaling complex，DISC)，procaspase-9 被募集到凋亡體后，通過其內(nèi)在的酶活性而自我活化［12］。異源活化通常發(fā)生在效應(yīng)caspase，即效應(yīng)procaspase 被其上游caspase 或其它蛋白酶活化。

起始caspase 以無活性單體形式存在，當(dāng)DISC募集procaspase-8、-10 后，局部caspase 單體濃度升高，最終以形成同源二聚體的形式自我活化［13］?；罨^程是將N-端的前結(jié)構(gòu)域切除，并將大、小亞基之間的活化環(huán)水解。然而，procaspase-9 的活化過程有所不同，且與apaf-1 密切相關(guān)，詳見下文。

效應(yīng)caspase 單體合成后以無活性的二聚體形式存在，酶原的活性被大、小亞基之間的活化環(huán)所抑制。上游caspase 先后水解活化環(huán)及前結(jié)構(gòu)域與大亞基之間的連接使其活化、成熟。活化、成熟后，效應(yīng)caspase 的催化區(qū)特異性識別底物P1 位天冬氨酸并將其水解。效應(yīng)caspase 的酶活性中心由大、小亞基所包含的3 個氨基酸(179 位精氨酸、283 位谷氨酸和341 位精氨酸)殘基所組成［14］。

1.3 Apaf-1 的結(jié)構(gòu)與功能 Apaf-1 的N 端為CARD，能結(jié)合procaspase-9;C 端含12-13 個重復(fù)的WD40 結(jié)構(gòu)域;兩端由核苷酸結(jié)合及寡聚化反應(yīng)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)連接。CytC 通過與WD40 結(jié)合參與apaf-1 活化過程。未活化的apaf-1 在胞漿內(nèi)與dATP 或ATP 結(jié)合，以無活性的單體形式存在。其C 端覆蓋于CARD 及NOD 的表面，阻止procaspase-9 的結(jié)合及多聚化。當(dāng)CytC 與WD40 結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，dATP 或ATP 水解供能，使C 端移位，Apaf-1 構(gòu)象改變，CARD 暴露。7個Apaf-1 聚集形成凋亡體，procaspase-9 被募集到CARD，自我催化剪切大、小亞基之間的連接后被活化。與procaspase2，8，10 不同，caspase-9 的前端結(jié)構(gòu)域在凋亡體內(nèi)并不被切除，通過它與Apf-1 結(jié)合才能維持其催化活性［15］。

2 線粒體外膜通透性的變化

線粒體外膜通透性改變(Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)是細(xì)胞凋亡過程中不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵點，它與BCL-2 家族成員的活化，透性轉(zhuǎn)化孔(permeability transition-pore，PTP)開放，ROS 以及caspase 等均有著直接關(guān)系。

2.1 BCL-2 家族與MOMP 的關(guān)系 BCL-2 蛋白家族對細(xì)胞通透性的改變至關(guān)重要，目前有三種假說解釋BCL-2 蛋白家族如何參與MOMP，分別闡述如下。

2.1.1 直接激活模式 該模式假定BH3-only 蛋白直接激活BAX、BAK，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加。在正常細(xì)胞中，BH3-only 蛋白沒有活性，或被家族中抗凋亡蛋白綁定而失去活性。細(xì)胞接受凋亡信號后，“BH3-only 凋亡執(zhí)行蛋白”通過轉(zhuǎn)錄、翻譯或移位被激活，或“BH3-only 凋亡感受蛋白”與抗凋亡蛋白結(jié)合后釋放“BH3-only 凋亡執(zhí)行蛋白”?！癇H3-only 凋亡執(zhí)行蛋白”被激活或游離后激活BAX 或BAK，使其在線粒體外膜打孔，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此模式中抗凋亡蛋白通過直接綁定凋亡執(zhí)行蛋白行使功能，而不是直接與BAX、BAK 結(jié)合［16～18］。

2.1.2 間接模式 此模式假定BAX、BAK 在胞漿內(nèi)具有活性，與抗凋亡蛋白結(jié)合后，活性被抑制。接受凋亡刺激后，BH3-only 蛋白競爭性結(jié)合抗凋亡蛋白，使BAX、BAK 游離、聚集。因BH3-only 家族成員選擇性地與抗凋亡蛋白結(jié)合，如Bim、Puma 能與所有抗凋亡蛋白緊密結(jié)合，Noxa 只能與Mcl-1，BFL1/A1 結(jié)合，Bad 只能結(jié)合BCL-2、BCL-xL 和BCL-w，BCL-xL、MCL-1 只能與BAK 結(jié)合，但幾乎所有BH3-only 家族成員都能與BCL-xL、MCL-1 二者之一結(jié)合，所以該模式需要多種BH3-only 蛋白共同參與［16～18］。

2.1.3 嵌入模式 此模式假設(shè)在即將凋亡的細(xì)胞中，BH3-only 凋亡執(zhí)行蛋白需在線粒體外膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面與BAX、BAK 結(jié)合。生理情況下，膜表面的BH3-only 蛋白以及BAX/BAK 通過構(gòu)象改變將胞漿內(nèi)的抗凋亡蛋白募集到膜表面，并將其激活;激活后抗凋亡蛋白與“BH3-only 執(zhí)行蛋白”及BAX/BAK結(jié)合，抑制二者功能，行使抗凋亡作用。接受凋亡信號后，“BH3-only 凋亡感受蛋白”與抗凋亡蛋白結(jié)合，中和其結(jié)合“BH3-only 凋亡執(zhí)行蛋白”及BAX/BAK 的能力，后兩者被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。上述反應(yīng)均為可逆反應(yīng)，且膜參與反應(yīng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，所以線粒體膜在此過程中是參與者而不是被動的接受［19］。

2.2 PTP 與MOMP 的關(guān)系 PTP 位于線粒體外膜，由三部分構(gòu)成:位于線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)、位于線粒體內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白(adenine nucleotide transporters，ANT)以及親環(huán)素D(cyclophilin D，CypD)。ANT 是一種特殊的ATP/ADP 轉(zhuǎn)運蛋白;CypD 是一種分子伴侶，具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶活性;直接與ANT 相連，位于線粒體基質(zhì)內(nèi)。正常情況下，PTP 處于低電壓狀態(tài);凋亡過程中，1，3，4 三磷酸肌醇介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放，致使線粒體鈣超載，PTP 轉(zhuǎn)為高電壓狀態(tài)并開放。這種轉(zhuǎn)換是不可逆的，且與鈣和PTP 結(jié)合位點的飽和度密切相關(guān)。PTP 的開放，造成水和離子在胞質(zhì)與線粒體基質(zhì)間自由擴(kuò)散，線粒體膜電位瓦解，氧化磷酸化解偶聯(lián)，線粒體腫脹，最終導(dǎo)致線粒體外膜破裂，膜間隙內(nèi)物質(zhì)釋放。另外，線粒體基質(zhì)鈣濃度升高刺激ROS 和游離脂肪酸合成，進(jìn)一步促進(jìn)PTP 開放［20］。

2.3 活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)與MOMP 的關(guān)系 線粒體膜電位瓦解，CytC 移位導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)，活性氧、過氧化氫(H2O2)以及OH-等ROS 大量生成［21］。ROS 促使DNA 斷裂、線粒體外膜蛋白分子及脂質(zhì)雙分子層被氧化;外膜通透性增加或破裂，膜間隙內(nèi)物質(zhì)釋放入胞漿。

2.4 Caspase 與MOMP 的關(guān)系 caspase 同樣可以增加線粒體外膜通透性，如procaspase-2 能插入線粒體膜激發(fā)與心磷脂結(jié)合的CytC 釋放［22］。Ricci JE 等發(fā)現(xiàn)caspase-3 能進(jìn)入線粒體并裂解NDUF1(NDUF1 是 呼 吸 鏈 中 復(fù) 合I 的 組 成 部 分)［23］;Arnoult D 等發(fā)現(xiàn)caspase-3 特異性NDUF1 裂解區(qū)突變在凋亡過程中能保護(hù)線粒體功能［24］。雖然實驗已證實某些caspase 在MOMP 中的作用，但具體機(jī)制仍不明確。

3 細(xì)胞凋亡的兩條主要途徑

3.1 凋亡的線粒體途徑 線粒體外膜50%以上由蛋白質(zhì)組成，分子量小于5 kDa 的小分子物質(zhì)(包括Ca2+)能自由通過線粒體外膜［25］。各種凋亡刺激導(dǎo)致線粒體外膜通透性增強，線粒體內(nèi)、外膜間隙內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白，如CytC、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)、Smac/DIABLO、核酸內(nèi)切酶(endonuclease G，Endo G)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosisinducing factor，AIF)、HtrA2/Omi、Hsp60、Hsp10 以及腺苷酸激酶釋放入胞漿。CytC 與apaf-1 結(jié)合形成一個單體，七個單體聚集形成凋亡體，凋亡體通過CARD 募集procaspase-9 并使其活化、成熟。成熟的caspase-9 進(jìn)一步激活效應(yīng)caspase-3，-6，-7。其中caspase-3 最具代表性，它裂解PARP［poly(ADP-ribose)Polymerase，多聚(ADP-核糖)聚合酶］，使DNA 修復(fù)終止;活化核酸內(nèi)切酶，其特異性切割核小體間的連接序列，DNA 斷裂成n×180 ～200bp 大小的片段，同時破壞細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、核蛋白等，使細(xì)胞失去正常形態(tài)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡［26］。

3.2 凋亡的外源途徑 凋亡的外源途徑由細(xì)胞膜上的死亡受體介導(dǎo)，迄今已發(fā)現(xiàn)有五大類凋亡受體，分別為腫瘤壞死因子受體1(tumour necrosis factor type-I receptor，TNFR1)、Fas/CD95、DR3、和TRAILR1、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)受體1、2(TNF-related apoptosis-inducing ligand R1、R2，TRAIL-R2)。它的胞質(zhì)區(qū)均包含一個死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)，由80 個氨基酸組成，該結(jié)構(gòu)域?qū)δ承┧劳鍪荏w如TNFR1、CD95、TRAIL-R1、TRAIL-R2 所介導(dǎo)的凋亡過程是必需的。當(dāng)死亡配體與受體結(jié)合后，受體通過其胞漿區(qū)的DD 募集相應(yīng)的銜接蛋白(Adaptor protein)，最終形成DISC。DD 是一段高度保守的氨基酸序列，若一個重要殘基突變，相應(yīng)受體便失去功能。如TNFR1 先后與腫瘤壞死因子相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(TNFR-associated death domain，TRADD)、FAS 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FAS-associated death-domain，F(xiàn)ADD)以及procaspase-8 結(jié)合形成DISC。FADD 由一個N 端的DED 和一個C 端的DD 構(gòu)成［27］。FAS與TRAIL 則直接募集FADD 和procaspase-8，不需TRADD 介導(dǎo)。與DISC 結(jié)合后，procaspase-8 經(jīng)同源活化形成caspase-8。I 型細(xì)胞中，活化的caspase-8通過異源活化激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。II 型細(xì)胞中，活化的caspase-8 較少，不能激活足夠的caspase-3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此時，caspase-8 通過裂解BID 形成截短的BID(truncated BID，tBID)，激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑，將死亡信號放大。tBID 移位到線粒體外膜，通過構(gòu)想改變誘導(dǎo)Bak 形成寡聚體［28］，激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑。tBID 被認(rèn)為是內(nèi)外凋亡途徑的結(jié)合點。

除與FADD 結(jié)合外，TRADD 還可結(jié)合受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)和腫瘤壞死因子受體連接因子2(TNF-receptor-associated factor 2，TRAF2)。因此，TNF 誘導(dǎo)的信號在其受體與TRADD 結(jié)合后出現(xiàn)兩種情況，募集FADD 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者募集TRAF2/RIP 后激活NF-kB 和c-Jun N-terminal kinase(JNK)途徑［29］。

4 展望

凋亡機(jī)制的研究對于深入了解組織缺血重構(gòu)、缺血再灌注、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、腫瘤等疾病的病理生理機(jī)制有深遠(yuǎn)意義，有助于進(jìn)一步認(rèn)識疾病的本質(zhì)，在此基礎(chǔ)上開發(fā)針對凋亡機(jī)制的靶向藥物，提高療效。目前已有部分類似藥物進(jìn)入臨床研究，如Oblimersen，一種BCL-2 反意義鏈，聯(lián)合替莫唑胺等藥物用于治療晚期黑色素瘤，已經(jīng)進(jìn)入I 期臨床試驗［30］;BH3-only 類似物，ABT-263，用于治療肺癌已進(jìn)入二期臨床試驗［31］;AT-101 治療前列腺癌已進(jìn)入I/II 期臨床試驗［32，33］;Obatoclax 聯(lián)合依托泊苷及順鉑能提高小細(xì)胞肺癌患者生存率，已進(jìn)入I 期臨床實驗［34］，且療效令人鼓舞。然而，相比促細(xì)胞凋亡藥物，我們對抗細(xì)胞凋亡藥物的開發(fā)仍嫌不足。目前，對凋亡分子機(jī)制及晶體結(jié)構(gòu)的研究仍在繼續(xù)，期待更多分子靶向藥物被發(fā)現(xiàn)，為相關(guān)疾病治療提供新思路。

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