真菌感染實驗室診斷技術(shù)進(jìn)展

李 皇 盧平宣

(廣西壯族自治區(qū)百色市人民醫(yī)院 廣西百色 533000)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，大量廣譜抗菌素、各種激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，血液系統(tǒng)惡性疾病、器官移植和艾滋病患者的增加，侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)逐年增多，嚴(yán)重威脅患者的生命。據(jù)國外資料報道，艾滋病患者在其病程中患真菌感染的可能性為90%，真菌感染是艾滋患者的主要死亡原因，而我國HIV陽性人群特別是西南地區(qū)正以每年30%的速度增加。在發(fā)達(dá)國家，器官移植受者和惡性腫瘤患者中真菌感染的發(fā)病率高達(dá)20%～40%，而且往往是致命的感染。雖然感染的主要病原真菌仍然是念珠菌［1］，但曲霉菌、接合菌及新生隱球菌等也在不斷增加［2］。這些真菌導(dǎo)致的侵襲性感染相對一般細(xì)菌、病毒感染具有更高的病死率，嚴(yán)重危害人類的健康。

絕大多數(shù)IFI患者無特異的臨床表現(xiàn)，很難與其他侵襲性疾病區(qū)分，很大程度上依靠實驗室的檢查。傳統(tǒng)的真菌感染的診斷依靠常規(guī)真菌分離、培養(yǎng)和組織病理鑒定等，培養(yǎng)需時長且難成功，病理不易鑒定，難以滿足臨床快速診治的需要。國內(nèi)外學(xué)者近年來已經(jīng)開始逐步認(rèn)識到深部真菌感染早期診斷的重要性［3］，且取得了一些突破性的研究進(jìn)展［4］，為指導(dǎo)臨床工作提供了較好的依據(jù)。本文就近年來IFI實驗室在真菌感染診斷方面的研究進(jìn)展綜述如下。

1 組織病理學(xué)方法

組織病理學(xué)是深部真菌感染重要的診斷方法之一，多年來人們一直致力于探討組織病理學(xué)新方法鑒定組織中真菌的種屬，以提高病原學(xué)診斷水平，并指導(dǎo)治療。除常用的真菌病原體染色方法外，免疫組化方法通過檢測真菌抗原特異地診斷組織中真菌病原體［5］，如新生隱球菌、馬爾尼菲青霉菌、曲霉菌和念珠菌等等。免疫染色除其診斷的特異性外，還可使組織中稀少存在的孢子更易發(fā)現(xiàn)，而免疫組化技術(shù)比組織化學(xué)方法更加敏感。免疫組化是繼培養(yǎng)法這一金標(biāo)準(zhǔn)之后最特異的診斷真菌感染的手段之一。但免疫組化法并未完全解決種特異性問題，特別是對于曲霉菌。而原位雜交技術(shù)利用核酸分子堿基配對互補(bǔ)的原理檢測目的基因，特異性強(qiáng)，近十幾年來，已有數(shù)位研究者以此方法用于真菌感染的組織病理學(xué)研究，目前已有用于念珠菌感染、曲霉感染和卡氏肺孢子蟲感染的報道［6］，但該探針仍未能徹底解決與黃曲霉的交叉問題。隨著真菌rDNA基因信息的完善和各種軟件包的應(yīng)用，探針的設(shè)計變得更準(zhǔn)確和容易，費(fèi)用明顯降低，非放射性探針的標(biāo)記使原位雜交更安全，越來越多的實驗室有能力開展此項技術(shù)。

2 快速培養(yǎng)鑒定方法

直接顯微鏡檢查和病原體培養(yǎng)特別是血培養(yǎng)方法仍然是臨床檢測真菌血癥的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于很多病原體直接鏡檢檢出率不高，病原體培養(yǎng)需要時間長，使危重患者的診斷治療存在一定的延時性，而且這些常規(guī)技術(shù)常常受到檢驗人員的技術(shù)熟練程度和標(biāo)本的采集方法、部位和采集時機(jī)等諸多主觀因素的影響，有時不能夠得到客觀的陽性結(jié)果，常常延誤了患者的最佳治療時機(jī)。但培養(yǎng)法對于一些真菌可以進(jìn)行藥物的敏感性實驗，為臨床的用藥提供支持，且不同的菌株毒力和藥物敏感性各不相同，所以將分離菌鑒定到種的水平對臨床非常重要。因此很多學(xué)者致力于傳統(tǒng)方法的改進(jìn)以求更加準(zhǔn)確、快速地鑒定侵襲性真菌［7］。為了提高培養(yǎng)的陽性率進(jìn)行了很多改進(jìn)，如解離離心培養(yǎng)管和自動監(jiān)測的血培養(yǎng)瓶的應(yīng)用等等，在一定程度上縮短了結(jié)果報告的時限。

系統(tǒng)性真菌感染目前仍然以酵母樣真菌為主，臨床上已有各種商品化的鑒定培養(yǎng)基和試劑盒供應(yīng)。其中最簡便的方法是科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，利用酵母樣真菌在生長過程中產(chǎn)生的酶作用于培養(yǎng)基中的色原底物，使菌落在生長過程中呈現(xiàn)不同的顏色來鑒定酵母菌，可準(zhǔn)確鑒定白色念珠菌、熱帶念珠菌和克柔念珠菌等。另外酵母鑒定板和自動生化鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用為非白念珠菌的鑒定提供了方便，目前常用的鑒定板有API20C AUX、ID32、RAPID Yeast plus，自動生化鑒定系統(tǒng)包括 Vitek鑒定系統(tǒng)、Quantum II、Biolog系統(tǒng)等等，盡管在敏感性和特異性方面也存在一定的問題，尤其是對毛孢子菌、都柏林念珠菌和隱球菌的鑒定。因此臨床迫切需要發(fā)展新技術(shù)，建立完善的非培養(yǎng)的快速診斷深部真菌病，且能夠?qū)陀^評價療效和預(yù)后皆有指導(dǎo)意義的方法。

3 血清學(xué)檢測方法

抗體檢測用于常見條件性侵襲性真菌感染，早期診斷價值不大，難以達(dá)到較高的敏感性和特異性，原因主要是占深部真菌感染90%以上的念珠菌是正常菌叢之一，正常人血中也有高效價的抗體;另外系統(tǒng)性真菌感染多發(fā)生于免疫機(jī)能不正常的患者，難于產(chǎn)生抗體，常會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。但真菌抗體檢測對某些地方性條件性真菌感染顯示出一定的應(yīng)用價值。Alexander BD等［8］利用從真菌提取的天然抗原，成功建立了多種地方性真菌病血清學(xué)檢測方法，用于包括芽生菌病、球孢子菌病，組織胞漿菌病、副球胞子菌病和毒霉病的早期診斷及流行病學(xué)調(diào)查，并顯示出較高的敏感性和特異性。

念珠菌抗原由于在血循環(huán)中很快被清除，因此抗原檢測也難以達(dá)到預(yù)想的敏感度，但相比之下抗原檢測比抗體檢測具有更高的診斷價值，因此近年來一些針對真菌細(xì)胞壁抗原、代謝產(chǎn)物等檢測的新方法成為研究熱點，其中一些試劑已有商品化試劑盒，也在臨床逐步應(yīng)用。如半乳甘露聚糖(GM)是第一個用于侵襲性曲霉菌病的抗原檢測。Mart KA等［9］用曲霉菌的半乳甘露聚糖酶免疫分析法檢測患者的血清結(jié)果表明，以0.5為陽性臨界值可提高檢測的敏感性和特異性。但GM血癥常為一過性，故應(yīng)對高危人群進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。除GM檢測曲霉的半乳甘露糖抗原外，目前檢測的真菌抗原還有如檢測血清中抗烯醇化酶抗體、分泌型門冬酰胺蛋白酶(secreted aspartyl proteinase，Sap)和甘露聚糖抗體等來診斷深部念珠菌感染。但依靠這些檢測手段的單一方法敏感度和特異度都不夠穩(wěn)定，可采用聯(lián)合抗原檢測的方法。甘露聚糖為念珠菌細(xì)胞壁成分，Bio-Rad公司已有試劑盒(Platelia Candida antigen test)應(yīng)用于臨床，一般將甘露聚糖抗原檢測與抗體檢測相結(jié)合，有助于念珠菌感染的早期診斷及提高診斷的靈敏度。李若瑜等［10］采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測念珠菌甘露聚糖敏感度為64.3%，特異度為97.2%;曲霉菌半乳甘糖抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗的敏感度在50%～90%之間。烯醇化酶為白念珠菌胞漿蛋白，研究顯示只有在深部白念珠菌感染時才大量釋放烯醇化酶，而寄生在體表部位的白念珠菌一般不會釋放此酶［11］。(1-3)-B-D-葡聚糖(BG)是許多真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分，是一種真菌廣譜循環(huán)標(biāo)志物，細(xì)菌、病毒和哺乳動物體內(nèi)不含該成分，因此可作為深部真菌感染的指標(biāo)。目前已有多種商業(yè)化方法檢測BG，在世界范圍應(yīng)用廣泛，檢測敏感度為 78% ～100%，特異度為 88% ～100%［12］。BG可用于早期發(fā)現(xiàn)深部真菌感染，但不能區(qū)分是何種真菌感染，另外新生隱球菌感染并不能在血及腦脊液中測到BG，接合菌屬如毛霉菌和根霉菌由于細(xì)胞壁缺乏(1-3)-BD-葡聚糖，所引起的感染也無法檢測［13］。所以提倡將BG檢測和GM檢測聯(lián)合起來，可以增加診斷的敏感性。

隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的不斷進(jìn)展，血清真菌代謝產(chǎn)物檢測也得到迅速發(fā)展。真菌代謝產(chǎn)物主要包括D-阿拉伯醇、L-阿拉伯醇和甘露聚醇。采用酶熒光法檢測血、尿標(biāo)本D-阿拉伯糖醇/肌酐比值或GC-MS法檢測血、尿標(biāo)本D-阿拉伯糖醇/L-阿拉伯糖醇比值，可快速預(yù)測系統(tǒng)性念珠菌感染，但由于不能發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇的克柔念珠菌、光滑念珠菌和新生隱球菌等三種真菌，目前很難在臨床實驗室應(yīng)用［14］?？焖侔l(fā)展起來的質(zhì)譜分析技術(shù)不僅用于真菌感染的診斷檢測，也廣泛應(yīng)用于真菌毒素的檢測［15］。Jegorov A 等［16］使用質(zhì)譜分析，根據(jù)特異真菌代謝產(chǎn)物快速地鑒定40多個不同真菌菌株。但由于檢測費(fèi)用的原因，質(zhì)譜分析目前并不能在臨床實驗室廣泛應(yīng)用。

4 分子生物學(xué)方法

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)已成功地應(yīng)用于某些深部真菌感染的診斷以及耐藥基因的檢測。分子生物學(xué)主要以聚合酶鏈反應(yīng)(plymerase chain reaction，PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的-系列分子診斷方法，通常先采用真菌通用引物對待檢標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，然后再采用屬或種特異性引物對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增，即將DNA放大數(shù)百萬倍后再進(jìn)行測定，所以遠(yuǎn)比培養(yǎng)法敏感，可以簡便、快速地鑒定多種醫(yī)學(xué)重要真菌，廣泛應(yīng)用于病原真菌的分型、鑒定和親緣關(guān)系的研究。PCR技術(shù)的應(yīng)用是目前真菌感染診斷中最活躍的領(lǐng)域。

由于白念珠菌和曲霉菌是臨床常見感染真菌，其分子生物學(xué)診斷研究進(jìn)展也比較快，目前主要有基于白念珠菌ITS、rDNA、IGS 基因保守區(qū)的普通 PCR、PCR-RFLP、RAPD、Rea1-time-PCR及針對胞外抗原基因的EIA、PCR-EIA等［17］。其中聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多肽性分析(PCR-SSCP)可將曲霉鑒定到屬的水平，并可一次性對煙曲霉和黃曲霉進(jìn)行鑒別［18］。隨機(jī)擴(kuò)增多肽性DNA(RAPD)分析通過擴(kuò)增靶核苷酸細(xì)胞DNA，經(jīng)凝膠電泳進(jìn)行DNA片斷大小及數(shù)量的多肽性分析，已應(yīng)用于酵母菌及曲霉菌的鑒定、分類和流行病學(xué)研究，方法簡便可以大規(guī)模使用，但重復(fù)性相對較差，常采用多種隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和與其他方法聯(lián)合應(yīng)用，提高穩(wěn)定性［19］。限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)利用不同種屬的真菌基因組DNA順序存在差異，使用核酸限制性內(nèi)切酶識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶，酶切后產(chǎn)生的特異DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳形成酶切圖譜，借此可對相近菌種或同種內(nèi)變種進(jìn)行分析［20］。實時熒光定量PCR(rea1-time-PCR)技術(shù)即在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析，可對臨床重要曲霉菌和念珠菌進(jìn)行區(qū)分［21］。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(而非一對)PCR引物擴(kuò)增完整的片段，其敏感性比普通PCR要高1000倍。Pongpom等［22］應(yīng)用巢式PCR檢測血清中的馬爾尼菲青霉菌DNA，檢測敏感度100%，特異性達(dá)到68.6%。趙軍等采用自行設(shè)計的煙曲霉特異性引物用巢氏PCR技術(shù)快速診斷侵襲性煙曲霉感染，在臨床確診或擬診的侵襲性曲霉感染患者中，檢測靈敏度和特異性分別達(dá)到100%和83.3%［23］。而在曲霉菌感染的分子生物學(xué)診斷方面，基于核酸水平的普通PCR、兩步PCR、實時PCR和基于表面抗原的ELISA免疫印跡等技術(shù)，以其特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點在曲霉病的診斷及分型中發(fā)揮著日趨重要的作用。

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