基于改進(jìn)QuEChERS法聯(lián)合超高效液相色譜-質(zhì)譜法的人參中禁用農(nóng)藥殘留分析△

武曉麗，丁自勉*，柯潤輝

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.中輕檢驗認(rèn)證有限公司，北京 100015

QuEChERS 是quick、easy、cheap、effective、rugged、safe的縮寫，意即快速、簡單、廉價、有效、堅固耐用和安全，是由美國科學(xué)家2003 年開發(fā)的一種用于蔬菜、水果中農(nóng)藥多殘留測定的樣品前處理方法，包括乙腈提取/分離和分散固相萃取凈化2個主要過程[1]。為了使QuEChERS對復(fù)雜基質(zhì)和分析物有更好的萃取效果，研究人員主要針對萃取鹽析和吸附劑2 個關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化[2]。前者由原始的非緩沖鹽版本演化為2個官方分析方法，即以醋酸鹽為緩沖液的美國AOAC 官方分析方法2007.01[3]和以檸檬酸鹽為緩沖液的歐盟官方方法EN15662[4]。在吸附劑優(yōu)化方面，主要評估不同吸附劑的凈化效果[5]，如N-丙基乙二胺（PSA）通常用于去除脂肪酸、糖、有機(jī)酸和一些色素；十八烷基鍵合硅膠（C18）可有效地去除高脂樣品；石墨化碳黑（GCB）主要去除共提色素（如葉綠素和類胡蘿卜素等）；無水硫酸鎂用于去除水分。經(jīng)過改進(jìn)后，QuEChERS 能夠減少不穩(wěn)定農(nóng)藥分解、減弱基質(zhì)效應(yīng)和提高農(nóng)藥回收率。

近年來，QuEChERS 在中藥農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用也日漸普及。例如，用無水硫酸鎂1200 mg、C18100 mg、PSA 300 mg為凈化劑，建立了廣陳皮中39 種禁用農(nóng)藥的氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS/MS）檢測[6]；用商業(yè)化的QuEChERS 提取包和凈化管，建立了貝母類藥材中53種農(nóng)藥殘留GC-MS/MS測定[7]。但是中藥種類眾多、基質(zhì)復(fù)雜，除了富含色素、有機(jī)酸等基質(zhì)外，還含有黃酮、萜、皂苷等類的藥理活性成分[8]，經(jīng)典的QuEChERS 凈化包可能會吸附一部分農(nóng)藥，造成回收率下降[9]，因此，需要對凈化劑的種類和配比進(jìn)行調(diào)整。例如，在建立白芷中禁用農(nóng)藥殘留檢測方法時發(fā)現(xiàn)，因白芷藥材中植物色素量較少，GCB 會吸附平面型農(nóng)藥，導(dǎo)致其回收率降低[10]；閆君等[11]針對當(dāng)歸中色素含量低，含有揮發(fā)油等特點(diǎn)，選擇無水硫酸鎂800 mg、PSA 150 mg和C18150 mg 進(jìn)行凈化，能夠減弱基質(zhì)效應(yīng)，試驗的102種農(nóng)藥的回收率為52%～128%。

隨著《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版的實(shí)施，QuEChERS成為藥材及飲片（植物類）中禁用農(nóng)藥多殘留測定法的樣品制備標(biāo)準(zhǔn)方法之一，其中分散固相萃取凈化劑為無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg、GCB 90 mg[12]。但是在日常檢測中，本研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)上述吸附劑配比會造成一些禁用農(nóng)藥（如殺蟲脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺?。┗厥章势偷膯栴}。這可能是由于在部分中藥基質(zhì)中，某些吸附劑對目標(biāo)農(nóng)藥產(chǎn)生吸附，因此需要對吸附劑配比進(jìn)行調(diào)整。但目前尚未有針對上述現(xiàn)象的系統(tǒng)研究。

人參是一種常用的藥食兩用中藥材，《中國藥典》 2020 年版記載其為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效[13]。本研究以人參為例，對QuEChERS 吸附劑用量配比進(jìn)行優(yōu)化，用超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對30 種禁用農(nóng)藥進(jìn)行檢測，并對方法的回收率、重復(fù)性、線性等指標(biāo)進(jìn)行考察。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；5500QTRAP型質(zhì)譜儀（美國AB SCⅠEX公司）；SiO-7512 型自動QuEChERS 樣品制備系統(tǒng)（北京本立科技有限公司）。

1.2 試藥

人參藥材購于安國藥材市場，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所李國強(qiáng)副研究員鑒定為人參Panax ginsengC.A.Mey.，粉碎后過三號篩，置于-20 ℃冰箱中，備用；色譜純乙腈和質(zhì)譜級甲酸購自美國Fisher 公司；分析純無水硫酸鎂、無水醋酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18、PSA、硅膠、GCB 購自上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司；禁用農(nóng)藥混合對照品（批號：CDAA-M-490407-TX，2～20 mg·L-1）購自上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，用前取0.5 mL稀釋至10 mL（0.1～1.0 mg·L-1），置于-20 ℃冰箱中，備用。

2 方法

2.1 UPLC-MS/MS條件

2.1.1色譜條件 Thermo Scientific Hypersil GOLD色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～0.5 min，30%A；0.5～9.0 min，30%～90%A；9.0～13.0 min，90%A；13.0～14.0 min，90%～30%A；14.0～18.0 min，30%A）；流速為0.20 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESⅠ），監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子掃描；離子噴霧電壓（ⅠS）+5.5 kV；離子源溫度550 ℃，霧化氣（GS1）壓力50 psi（1 psi≈6.895 kPa），輔助氣（GS2）壓力50 psi，氣簾氣（CUR）壓力35 psi。監(jiān)測離子對、碰撞電壓（CE）等參照《中國藥典》2020年版，并根據(jù)儀器條件稍作調(diào)整（表1）。

表1 人參中各農(nóng)藥的tR、監(jiān)測離子對及CE

2.2 樣品前處理

2.2.1QuEChERS 樣品前處理 參照《中國藥典》（四部）2341農(nóng)藥殘留量測定法第五法[12]：稱取人參粉末3 g，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使浸潤，放置30 min，加入無水硫酸鎂與無水硫酸鈉共7.5 g（4∶1）后立即搖散，振蕩3 min，冰浴10 min，離心5 min（4000 r·min-1，離心半徑為9.5 cm）。取上清液9 mL，置裝有凈化劑的分散固相萃取凈化管中，渦旋混勻，劇烈振蕩5 min 凈化，離心5 min（4000 r·min-1，離心半徑為9.5 cm）。精密吸取上清液5 mL，氮吹濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至1.0 mL，精密加入水0.3 mL，混勻，過0.22 μm 濾膜，取續(xù)濾液待測。

2.2.2對照品溶液制備 取混合對照品0.5 mL 稀釋至10 mL（0.1～1.0 mg·L-1），置于-20 ℃冰箱中，備用。

2.2.3吸附劑種類優(yōu)化 分別使用1）經(jīng)典分散固相萃取混合凈化管（含無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg、GCB 90 mg）；2）PSA 300 mg和無水硫酸鎂900 mg；3）C18300 mg和無水硫酸鎂900 mg；4）硅膠300 mg和無水硫酸鎂900 mg；5）GCB 90 mg 和無水硫酸鎂900 mg；6）無水硫酸鎂900 mg 的凈化管對提取的人參基質(zhì)進(jìn)行凈化處理，其他處理過程同2.2.1項。

2.2.4硅膠、C18和PSA 用量優(yōu)化 在前期研究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)硅膠、C18和PSA 會造成部分農(nóng)藥回收率下降，因此進(jìn)一步對其進(jìn)行減量優(yōu)化。當(dāng)硅膠、C18和PSA 分別均為300、250、200、150、100 mg 時，考察農(nóng)藥的回收率。

2.3 加樣回收試驗和精密度

精密稱定人參粉末3 g，分別添加禁用農(nóng)藥混合對照品（0.1～1.0 mg·L-1）30、300、600 μL，平行6次，按照2.2項下優(yōu)化好的吸附劑用量進(jìn)行樣品處理，考察方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)。

2.4 方法的線性、定量下限（LLOQ）和基質(zhì)效應(yīng)（ME）

取人參樣品粉末3 g，按照2.3項下方法制備空白溶液。取空白基質(zhì)溶液1.0 mL（6份），氮吹濃縮至約0.6 mL，分別加入混合對照品溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋混勻，即得基質(zhì)匹配對照品。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），通過計算和擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)（r）。按照公式（1）計算農(nóng)藥殘留分析中ME[9]。取標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)，計算照信噪比為10∶1時的相應(yīng)濃度為LLOQ。

ME=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1）×100% （1）

3 結(jié)果與分析

3.1 吸附劑種類優(yōu)化

人參提取液經(jīng)過2.2.3項下6種不同凈化管處理后，30種禁用農(nóng)藥回收率結(jié)果見圖1。第1～6種處理方式下，30 種禁用農(nóng)藥的回收率分別為59.6%～100.3%、68.8%～100.2%、75.2%～103.0%、60.8%～100.8%、84.7%～100.3%、82.6%～101.2%。經(jīng)過商業(yè)化分散固相萃取混合凈化管凈化后，殺蟲脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆的回收率都低于80%，分別為59.6%、69.8%、77.2%和61.4%；經(jīng)過PSA 300 mg和MgSO4900 mg凈化后，甲磺隆和氯磺隆的回收率低于80%，分別為76.6%、68.8%；經(jīng)過C18300 mg或者硅膠300 mg凈化后，殺蟲脒的回收率均低于80%，分別為75.2%和60.8%；而經(jīng)過GCB 90 mg 和無水硫酸鎂900 mg 凈化后，能夠有效去除人參中少量色素，且所有農(nóng)藥的回收率都在80%以上；經(jīng)過無水硫酸鎂900 mg 凈化后，所有農(nóng)藥的回收率都在80%以上，表明無水硫酸鎂不會造成農(nóng)藥回收率降低。因此，推測可能是因為PSA對甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆等磺酰脲類除草劑有吸附作用，C18和硅膠對殺蟲脒有吸附作用，造成這些農(nóng)藥的回收率降低。因此，進(jìn)一步對這3 種吸附劑用量進(jìn)行了優(yōu)化，并對吸附機(jī)制進(jìn)行探討。

圖1 不同凈化劑處理后30種禁用農(nóng)藥回收率

3.2 硅膠、C18和PSA用量優(yōu)化

硅膠表面有大量的羥基，有較強(qiáng)的極性，可以用于除去極性較大的雜質(zhì)。C18表面有非極性碳鏈和部分未鍵合的硅醇官能團(tuán)，可以除去非極性雜質(zhì)和一些極性雜質(zhì)。結(jié)果顯示（圖2A），隨著C18和硅膠用量的減少，殺蟲脒的回收率都逐漸增加。當(dāng)硅膠用量從300 mg 減少到100 mg 時，殺蟲脒回收率從60.8%逐漸提高到96.8%，尤其是當(dāng)硅膠用量＞250 mg 時，殺蟲脒的回收率＜70%。當(dāng)C18從300 mg減少到100 mg 時，殺蟲脒回收率從75.2%提高到86.5%，當(dāng)C18用量＜200 mg 時，殺蟲脒回收率＞80%。結(jié)果表明，過量的硅膠和C18都會對殺蟲脒有吸附作用，且硅膠的吸附作用更強(qiáng)。推測可能是硅膠上未鍵合的羥基與極性較強(qiáng)的殺蟲脒之間有吸附作用，C18和硅膠相比由于羥基的鍵合而對殺蟲脒的吸附作用減弱。綜上所述，C18和硅膠用于中藥禁用農(nóng)藥殘留凈化時，應(yīng)根據(jù)基質(zhì)的種類不同，減少用量。例如，在人參基質(zhì)中，當(dāng)C18用量為100～150 mg、硅膠用量為100 mg 時，殺蟲脒有較好的回收率（＞80%）。

PSA 是氨基吸附劑，其2 個氨基的酸度系數(shù)（pKa）分別為10.9、10.1[14]，能夠吸附酸性雜質(zhì)，可以用于樣品中有機(jī)酸、脂肪酸及部分色素等基質(zhì)的去除，但是過量的PSA 有可能會造成酸性農(nóng)藥的回收率降低。胺苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆的pKa 依次為4.20、3.75、3.40，都屬于弱酸性農(nóng)藥。如圖2B 所示，當(dāng)PSA 用量＜200 mg 時，3 種磺酰脲類除草劑的回收率都達(dá)到80%以上。當(dāng)PSA 從300 mg減少到100 mg 時，甲磺隆的回收率從76.5%增加到97.3%，胺苯磺隆回收率從83.6% 增加到100.6%，氯磺隆回收率從68.8%增加到104.9%。這可能是由于過量的PSA 和磺酰脲類除草劑上的氨基能夠形成很強(qiáng)的吸附作用，導(dǎo)致甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆的回收率降低。實(shí)驗中還發(fā)現(xiàn)，同等用量的PSA 時，農(nóng)藥的回收率胺苯磺隆＞甲磺?。韭然锹?，這可能是由于3 種農(nóng)藥的酸性依次增強(qiáng)（pKa 越小，酸性越強(qiáng)），與PSA 的吸附作用也增強(qiáng)，導(dǎo)致回收率降低。因此，當(dāng)PSA 用于磺酰脲類農(nóng)藥的樣品凈化時，需要針對不同的基質(zhì)，減少PSA 用量。

圖2 農(nóng)藥吸附劑用量優(yōu)化

綜上所述，在按照《中國藥典》2020 年版中的QuEChERS（無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg、GCB 90 mg 作為凈化吸附劑）對人參中禁用農(nóng)藥進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)C18和硅膠會使殺蟲脒回收率降低，PSA 會使甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆回收率降低，因此需要減少硅膠、C18和PSA 的用量。當(dāng)硅膠、C18和PSA 用量為100～150 mg時，殺蟲脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆有較好的回收率（＞80%）。下面以硅膠100 mg、C18150 mg、PSA 150 mg 和GCB 90 mg 為例，用于人參基質(zhì)中禁用農(nóng)藥的殘留分析，考察方法的應(yīng)用效果。

3.3 加樣回收率和精密度

按照《中國藥典》2020 年版規(guī)定，30 種禁用農(nóng)藥殘留的限度值為0.02～0.20 mg·kg-1[12]，選擇1/10限量值、限量值、2 倍限量值3 個添加水平，平行6次，在3.1、3.2項下優(yōu)化好的條件下，考察方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性。30 種農(nóng)藥的回收率和RSD 見表2，回收率為76.4%～108.0%，RSD 為0.9%～7.8%，能夠滿足分析方法的要求。

表2 人參中30種禁用農(nóng)藥的添加回收率和RSD

續(xù)表2

3.4 方法的線性和定量下限

30 種農(nóng)藥在人參基質(zhì)中含量的線性范圍、線性方程、r及LLOQ見表3。r為0.993 9～0.999 9，均大于0.990，有較好的線性。所有農(nóng)藥的LLOQ均低于《中國藥典》2020 年版定量限，能夠用于30 種禁用農(nóng)藥殘留的定量檢測。

表3 人參中30種農(nóng)藥殘留測定方法的線性和定量下限

3.5 ME

ME 在痕量分析中對結(jié)果的準(zhǔn)確度有顯著的影響。ME＞0 表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME＜0 表示基質(zhì)減弱效應(yīng)；ME＞50%或者＜-50%，表示有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)；20%＜ME＜50%，或者-50%＜ME＜-20%，表示中等的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME 在-20%～20%時，表示較弱或者可以忽略不計的基質(zhì)效應(yīng)。30 種禁用農(nóng)藥在人參中的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見圖3。人參基質(zhì)中有8種農(nóng)藥為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（ME＞0），22 種農(nóng)藥為基質(zhì)抑制效應(yīng)（ME＜0）。有2 種農(nóng)藥呈現(xiàn)較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，分別為苯線磷（51.4%）、水胺硫磷（-70.4%）。有9 種農(nóng)藥呈現(xiàn)中等的基質(zhì)效應(yīng)，如甲胺磷、甲磺隆等。有19 種農(nóng)藥（如殺蟲脒、久效磷、3-羥基克百威等）呈現(xiàn)較弱或者可以忽略不計的基質(zhì)效應(yīng)。

圖3 人參中30種禁用農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)

4 結(jié)論

本研究以人參為例，優(yōu)化了QuEChERS 用于中藥禁用農(nóng)藥殘留樣品前處理的凈化劑種類和用量，并對可能的吸附機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，過量的硅膠和C18會造成殺蟲脒回收率降低，PSA 會造成甲磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆等酸性農(nóng)藥回收率降低。對凈化劑用量進(jìn)行優(yōu)化后，30 種禁用農(nóng)藥的回收率都能夠滿足要求，且方法有較好的精密度、線性和定量限。本研究在不更換吸附劑種類的情況下，對吸附劑用量進(jìn)行配比優(yōu)化，彌補(bǔ)經(jīng)典QuEChERS 的不足，為其在中藥農(nóng)藥殘留，尤其是禁用農(nóng)藥殘留的檢測應(yīng)用提供方法參考。