環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于消化道和呼吸道病毒檢測的研究進(jìn)展＊

李文桂 綜述，陳雅棠 審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所 400016）

消化道病毒包括腸道病毒、肝炎病毒和急性胃腸炎病毒等，可分別引起肝炎、急性胃腸炎和手足口病等疾病，呼吸道病毒是呼吸性疾病的一種病原體。據(jù)報(bào)道90%以上急性呼吸道感染是由呼吸道病毒引起的。在收集到的消化道和呼吸道標(biāo)本中檢測到相應(yīng)病毒是診斷這類疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但通常陽性率較低，需要花費(fèi)大量的物力和人力等資源；隨后人們利用免疫學(xué)方法檢測這些病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生的循環(huán)抗原或循環(huán)抗體，盡管敏感性較高，但存在較多的假陽性；接著人們采用PCR方法檢測這些病毒，敏感性和特異性有了較大的提高，但昂貴的PCR儀購置限制了它的廣泛應(yīng)用，研制新的病毒檢測技術(shù)已迫在眉睫。

Notomi等［1］針對(duì)一段200bp左右的靶基因保守區(qū)域的6個(gè)特異序列設(shè)計(jì)4條引物，即上游內(nèi)部引物（FIP）、下游內(nèi)部引物（BIP）、上游外部引物（F3）和下游外部引物（B3），利用一種具有鏈置換反應(yīng)的DNA聚合酶和2對(duì)設(shè)計(jì)引物，對(duì)靶序列上的6個(gè)特異序列進(jìn)行核酸擴(kuò)增，在65℃的等溫條件下反應(yīng)1h即可將靶序列DNA擴(kuò)增109～1010倍，產(chǎn)生肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀，該技術(shù)命名為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop－media－ted isothermal amplification，LAMP）。為了提高擴(kuò)增效率，Nagamine等［2］設(shè)計(jì)了上游環(huán)狀引物（FLP）和下游環(huán)狀引物（BLP）。這對(duì)環(huán)引物可加快反應(yīng)速度，在30～45min即可實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增。LAMP技術(shù)具有較高的敏感性、較強(qiáng)的特異性，不需昂貴儀器，使用簡捷、花費(fèi)時(shí)間短，可目測判定結(jié)果等許多優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床微生物的快速診斷，在各級(jí)實(shí)驗(yàn)室具有廣闊的前景。隨后LAMP檢測消化道和呼吸道病毒的研究在國內(nèi)外迅速開展起來，并有了許多報(bào)道，本文就這些報(bào)道展開綜述。

1 消化道病毒LAMP檢測

1.1 腸道病毒 人腸道病毒71型（human enterovirus 71，HEV71）和口足疫病毒（foot－and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）均是常見的腸道病毒，可分別引起人的手足口病和家畜的口蹄疫。Nie等［3］針對(duì)HEV71的VP1基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RTLAMP，發(fā)現(xiàn)HEV71反應(yīng)管為陽性，而ECHO病毒對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管0.04TCID50；將其用于25例HEV71患者糞樣的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為100%。李坤等［4］針對(duì)HEV71的VP2基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)HEV71反應(yīng)管為陽性，而柯薩奇病毒A16型對(duì)照為陰性，其檢測HEV71的敏感性為100copy／mL；將其用于41份咽拭子標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為65.9%（27／41），與熒光定量PCR相當(dāng)。

Dukes等［5］針對(duì)FMDV的3DRNA聚合酶基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－PCR，發(fā)現(xiàn)FMDV反應(yīng)管為陽性，而豬水庖病毒、豬皰疹病毒、圣米格爾海獅病毒、牛杯狀病毒、馬鼻病毒A和牛鼻病毒等6種病毒對(duì)照均為陰性，其檢測FMDV的敏感性為每管10copy，與實(shí)時(shí)熒光RT－PCR相當(dāng)；將其用于98例患者標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為82.7%（81／98），而RTPCR為79.6%（78／98）。秦智鋒等［6］采用3D－RT－LAMP檢測證實(shí)FMDV的0型和亞洲Ⅰ型反應(yīng)管為陽性，而豬水庖病毒、藍(lán)耳病病毒和豬水泡性口炎病毒對(duì)照為陰性；將其用于檢測8份確診的口蹄疫臨床標(biāo)本均可獲得陽性結(jié)果。

1.2 肝炎病毒

1.2.1 乙型肝炎病毒（hepatitis virus B，HBV） HBV是乙型肝炎的病原體。楊勁等［7］針對(duì)HBV的S區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行LAMP，發(fā)現(xiàn)30份HBV反應(yīng)管為陽性，其檢測HBV的敏感性為40copy／mL。李青雅等［8］用S－LAMP檢測發(fā)現(xiàn)20份HBV反應(yīng)管為陽性，而10份鴨HBV對(duì)照為陰性。Cai等［9］針對(duì)HBV的pre－s／S區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行LAMP檢測發(fā)現(xiàn)HBV反應(yīng)管為陽性，而HCV對(duì)照為陰性，其檢測HBV的敏感性為210copy／mL；將其用于402份HBV患者血樣的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為73.4%（295／402）。

1.2.2 甲型肝炎病毒（hepatitis virus A，HAV） HAV是甲型肝炎的病原體。Yoneyama等［10］針對(duì)HAV的5′－未翻譯區(qū)序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)HAV反應(yīng)管為陽性，而脊髓灰質(zhì)炎病毒、諾如病毒和HEV對(duì)照為陰性，其檢測HAV的敏感性為0.6FFU／μL，而RT－PCR為0.5FFU／μL；將其用于5例HAV患者糞樣的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為100%（5／5），與 RT－PCR相當(dāng)。

1.2.3 丙型肝炎病毒（hepatitis virus C，HCV） HCV是丙型肝炎的病原體。李啟明等［11］針對(duì)HCV的5′－未翻譯區(qū)序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn) HCV反應(yīng)管為陽性，而HIV、HBV和流感病毒對(duì)照為陰性，其檢測HCV的敏感性為每管100copy；將其用于60份HCV患者血樣的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為98%（59／60），而 RT－PCR為100%（60／60）。

1.2.4 小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV） MHV是小鼠肝炎的病原體。袁文等［12］針對(duì) MHV的核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）編碼基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行LAMP，發(fā)現(xiàn)MHV反應(yīng)管為陽性，而小鼠腦脊髓炎病毒、漢坦病毒和犬冠狀病毒對(duì)照為陰性，其檢測MHV的敏感性為0.1 pg基因組DNA／μL，比RT－PCR靈敏10倍；將其用于55份臨床樣本的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為27.3%（15／55），而 RT－PCR為12.7%（7／55）。

1.3 諾如病毒 諾如病毒是一種杯狀病毒，是急性病毒性胃腸炎的常見病原體。Fukuda等［13］針對(duì)該病毒的RNA依賴的RNA聚合酶和衣殼蛋白編碼基因之間的保守區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)諾如病毒反應(yīng)管為陽性，而星形病毒、腺病毒和輪狀病毒對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管102～103copy；將其用于75例患者的糞樣檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為100%（75／75），而 RT－PCR為94.7%（71／75）。

宋克云等［14］針對(duì)該病毒的RNA聚合酶基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)48份諾如病毒GⅡ型反應(yīng)管為陽性，而12份輪狀病毒A對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為15.6pg基因組DNA／管，與RT－PCR相當(dāng)；將其用于48份患者的糞樣檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為95.8%（46／48），與 RT－PCR檢測結(jié)果一致。

羅劍鳴等［15］針對(duì)該病毒的RNA依賴的RNA聚合酶和衣殼蛋白編碼基因區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)諾如病毒GⅡ型反應(yīng)管為陽性，而輪狀病毒、星狀病毒和諾如病毒GⅠ型對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管1000 copy，與RT－PCR相當(dāng)；將其用于93份腹瀉患者的糞樣檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為36.6%（34／93），而 RT－PCR為38.7%（36／93）。

Yoda等［16］針對(duì)該病毒的衣殼蛋白編碼基因的N末端區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)諾如病毒GⅠ型和GⅡ型反應(yīng)管均為陽性，而輪狀病毒A和輪狀病毒C對(duì)照均為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管80～200copy；將其用于88例腹瀉患者的糞樣檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為81.8%（72／88），而RT－PCR為48.9%（43／88）。Fukuda等［17］用基于核苷酸序列擴(kuò)增的RT－LAMP檢測14個(gè)牡蠣樣品，發(fā)現(xiàn)諾如病毒GⅠ型和GⅡ型的陽性率分別為為64.3%（9／14）和78.6%（11／14）。Iturriza等［18］用RT－LAMP試劑盒檢測510份腹瀉患者的糞樣，發(fā)現(xiàn)其陽性率為68.8%（350／510），而 RT－PCR為70.8%（361／510）。

2 呼吸道病毒LAMP檢測

2.1 流感病毒A 流感病毒A是甲型流感的病原體。Poon等［19］針對(duì)該病毒的 M基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)22株流感病毒A反應(yīng)管為陽性，而11株其他流感病毒對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管10－3PFU，而PCR為每管10－2PFU；將其用于47例鼻咽分泌物標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為46.8%（22／47）。

Ito等［20］針對(duì)該病毒的血凝素 A（hemagglutinin A，HA）編碼基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)AH1株和AH3株反應(yīng)管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為10FFU／mL；將其用于83份鼻咽分泌物的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為85.9%（71／83），而病毒分離為94%（78／83）。

Kubo等［21］同樣針對(duì)該病毒的HA編碼基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)333株H1N12009流行株反應(yīng)管為陽性，而H3N2株對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管10copy；將其用于260個(gè)鼻咽拭子的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為52.3%（136／260），而RT－PCR為53.5%（139／260）。Ma等［22］用HA－RT－LAMP檢測發(fā)現(xiàn)26例H1N1株反應(yīng)管為陽性，而24例其他流感病毒株對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管40copy。聶凱等［23］用 HA－RT－LAMP檢測證實(shí)美國甲型H1N1流感樣品反應(yīng)管為陽性，而其他流感病毒株對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管60copy；將其用于30份人甲型H1N1流感患者的樣本檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為90%（27／30），而 RT－PCR為83.3%（25／30）。張永樂等［24］用 HART－LAMP檢測發(fā)現(xiàn)36例甲型H1N1流感咽拭子樣品為陽性；其檢測該病毒的敏感性為每管103copy，比RT－PCR敏感10倍。

2.2 禽流感病毒A 禽流感病毒A是禽流感的病原體。李啟明等［25］針對(duì)該病毒的HA編碼基因或神經(jīng)氨酸酶A（neuraminidase，NA）編碼基因分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)禽流感病毒A H5N1株反應(yīng)管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為每管10copy；將其用于51份患者的樣品檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為70.6%（36／51），與實(shí)時(shí)PCR相一致。

2.3 SARS冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS－Cov） SARS－Cov是 SARS的病原體。Thai等［26］針對(duì)該病毒的0RF1b基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行 RTLAMP，發(fā)現(xiàn)SARS－Cov反應(yīng)管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為每管0.01PFU，而RT－PCR為每管1PFU；將其用于59個(gè)鼻咽拭子的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為22.0%（13／59），而RTPCR為10.0%（6／59）。Poon等［27］同樣針對(duì)該病毒的0RF1b基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)SARS－Cov反應(yīng)管為陽性，而呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A和B對(duì)照均為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管10copy；將其用于31例鼻咽拭子的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為64.5%（20／31）。

2.4 人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV） HRSV是兒童呼吸道感染的主要病原體。Ushio等［28］針對(duì)該病毒的核殼蛋白編碼基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RTLAMP，發(fā)現(xiàn)HRSV反應(yīng)管為陽性，而流感病毒A和B、麻疹病毒以及腮腺炎病毒對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為0.06TCID50；將其用于50份鼻咽拭子的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為94%（47／50），而病毒分離和 RT－PCR 為58%（29／50）和84%（42／50）。Shirato等［29］同樣針對(duì)該病毒的核殼蛋白基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)HRSV反應(yīng)管為陽性，而冠狀病毒、流感病毒和腺病毒對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管0.01～0.10PFU；將其用于59例鼻咽拭子的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為61%（36／59），而病毒分離和RT－PCR為34%（20／59）和68%（34／59）。

2.5 麻疹病毒 麻疹病毒是麻疹的病原體。Fujino等［30］針對(duì)該病毒的核蛋白的編碼基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行LAMP，發(fā)現(xiàn)麻疹病毒反應(yīng)管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為0.04 TCID50，而RT－PCR為0.4TCID50；將其用于50例凍存4年的標(biāo)本和11個(gè)新鮮標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率分別為98%（49／50）和81.8%（9／11），而 RT－PCR分別為88%（44／50）和72.7%（8／11）。

2.6 腮腺炎病毒 腮腺炎病毒是流行性腮腺炎的病原體。Okafuji等［31］針對(duì)該病毒的血凝素－神經(jīng)氨酸酶（hemagglutinin－neuraminidase，HN）編碼基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行LAMP，發(fā)現(xiàn)腮腺炎病毒反應(yīng)管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為0.024PFU／μL，與RT－PCR相當(dāng)；將其用于75個(gè)唾液拭子的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為64.0%（48／75），而 RT－PCR為62.7%（47／75）。

2.7 風(fēng)疹病毒 風(fēng)疹病毒是風(fēng)疹的病原體。Mori等［32］針對(duì)該病毒的E1基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)風(fēng)疹病毒反應(yīng)管為陽性，而麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒和流感病毒對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為30PFU／mL；將其用于9例患者的標(biāo)本檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為77.8%（7／9），而病毒分離和 RT－PCR為33.3%（3／9）和66.7%（6／9）。

2.8 新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV） NDV是雞瘟病的病原體。Pham等［33］針對(duì)該病毒的融合基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物進(jìn)行RT－LAMP，發(fā)現(xiàn)38株NDV反應(yīng)管為陽性，而雞痘病毒和禽呼腸孤病毒對(duì)照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管0.5pg，與巢式PCR相當(dāng)；將其用于感染NDV 3d的雞肺氣管組織的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為75%（6／8），而感染6d標(biāo)本的陽性率為100%。

2.9 結(jié)膜炎腺病毒 結(jié)膜炎腺病毒是眼科感染的常見病原體。Wakabayashi等［34］針對(duì)該病毒的Ad1亞型、ad3亞型和Ad4亞型的第6區(qū)基因以及ad8亞型、ad19亞型和ad37亞型的纖維區(qū)基因分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物進(jìn)行LAMP，發(fā)現(xiàn)這些亞型反應(yīng)管均為陽性，其檢測該病毒的敏感性為每管103～104copy；將其用于13份臨床樣本的檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為84.6%（11／13），而PCR為100%（13／13）。

3 展 望

將LAMP技術(shù)用于消化道和呼吸道病毒的檢測具有許多好處。因?yàn)長AMP技術(shù)針對(duì)保守靶序列的6個(gè)特定片段設(shè)計(jì)2～3對(duì)相關(guān)引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，所以核酸擴(kuò)增具有較強(qiáng)的特異性；在LAMP剛開始反應(yīng)時(shí)，以6n倍量進(jìn)行核酸擴(kuò)增，在1h內(nèi)就能擴(kuò)增出109～1010copy的靶序列基因，所以靈敏度較高，其靈敏度可與實(shí)時(shí)定量PCR相當(dāng)，比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)的靈敏度提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)；因?yàn)長AMP反應(yīng)可生成肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀，所以用目測即可鑒定結(jié)果；因?yàn)長AMP反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，不需要變溫條件，所以不需要昂貴的PCR設(shè)備，操作步驟非常簡單，應(yīng)用方便，所以在基層應(yīng)用具有較廣闊的前景。

當(dāng)然LAMP技術(shù)也有一些不可避免的缺點(diǎn)。因?yàn)長AMP引物設(shè)計(jì)需專門軟件，需設(shè)計(jì)引物2～3對(duì)，設(shè)計(jì)程序繁瑣，所以引物篩選工作將花費(fèi)大量的時(shí)間和精力；因?yàn)長AMP引物之間可能存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)非特異條帶的擴(kuò)增，所以出現(xiàn)假陽性的概率較多；LAMP反應(yīng)擴(kuò)增的靶序列基因長度通常不超過300bp，與非特異擴(kuò)增的產(chǎn)物不宜鑒別；LAMP擴(kuò)增的靶基因序列通常較短，所以不能進(jìn)行基因的克隆、測序和表達(dá)；當(dāng)進(jìn)行常規(guī)LAMP反應(yīng)完畢后，打開反應(yīng)管時(shí)可造成氣溶膠污染；LAMP技術(shù)很難擴(kuò)增長度大于500bp的靶基因，所以不能進(jìn)行長鏈DNA擴(kuò)增。隨著時(shí)間的推移，LAMP技術(shù)將不斷得到完善，在不遠(yuǎn)的將來極有可能用于消化道和呼吸道病毒的臨床檢測。

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