肝素酶和CD44v6在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

鄧太兵，黃萬秀，唐鳳鳴

（1.四川省廣安市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 638500；2.四川省宜賓市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 644000）

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（nonsmall－cell lung cancer，NSCLC）在肺癌患者中所占比例約為80%；作者既往研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中CD44的表達(dá)率為52.27%［1］。CD44v6是CD44家族的主要成員，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)的黏附；而肝素酶是目前發(fā)現(xiàn)的惟一能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的內(nèi)源性糖苷酶，在腫瘤的轉(zhuǎn)移中具有重要的作用；腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要原因，基于以上分析，本研究擬檢測肝素酶及CD44v6在NSCLC組織中的表達(dá)，討論這兩種分子在NSCLC中表達(dá)的意義及其與預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2009年1月至2011年12月手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC的腫瘤標(biāo)本117例（肺癌組），取其中62例患者癌旁1cm并且經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為正常的肺組織為陰性對照（癌旁組）。其中男88例，女29例；年齡29～89歲，中位年齡57歲；病理分型為鱗癌36例，腺癌57例，腺鱗癌8例，支氣管肺泡癌13例，大細(xì)胞癌3例，病理學(xué)診斷由兩名以上具有10年以上工作經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)專家確診。NSCLC患者的TNM分期按2009年第7版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，其中Ⅰ期24例，Ⅱ期64例，Ⅲ期29例；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者68例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者49例；隨訪截止日期為2013年6月，生存期的計算為自手術(shù)日期至隨訪截止日期或死亡日期為止，結(jié)尾值為0，術(shù)后患者平均生存時間為27.6個月。

1.2 主要試劑 小鼠抗人CD44v6單克隆抗體購于美國RnD公司（Catalog：BBA13）、兔抗人肝素酶單克隆抗體購于美國Santa公司（Catalog：sc－25826）；辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（Catalog：ZB－2305）、山羊抗兔（Catalog：ZB－2301）二抗及 DAB顯色試劑盒（Catalog：ZLI－9032）購于北京中山金橋生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 腫瘤組織及癌旁正常組織石蠟切片使用二甲苯脫蠟，采用梯度乙醇水化。將切片放置在終濃度為0.01mol／L、pH值為6.0的檸檬酸鹽酸緩沖液中在溫度為97～100℃條件下進(jìn)行微波抗原修復(fù)15min，切片置室溫冷卻30min，用PBS沖洗3次，每次5min；然后分別滴加一抗后于4℃冰箱中孵育過夜，用PBS清洗3次，每次5min；按照一抗來源分別加入二抗并在37℃孵育30min，然后用PBS清洗3次，每次5min；嚴(yán)格按照DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，PBS代替一抗作為系統(tǒng)陰性對照。

1.3.2 圖像分析 使用日本Olympus公司生產(chǎn)的CX21顯微鏡，放大倍數(shù)為400倍觀察免疫組織化學(xué)切片，并進(jìn)行半定量評估，判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色即判定為陽性；參照Mathew等制定的分級標(biāo)準(zhǔn)，無陽性細(xì)胞或者陽性細(xì)胞小于5%為陰性（－），染色為黃色的細(xì)胞大于0小于50%或細(xì)胞染色為棕黃色的細(xì)胞小于30%為陽性（＋），染色為黃色的細(xì)胞大于50%或棕黃色細(xì)胞大于30%者為強(qiáng)陽性（＋＋）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，CD44v6和肝素酶的表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，CD44v6和肝素酶的表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)因素分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD44v6和肝素酶在NSCLC中的表達(dá) CD44v6表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)及胞膜呈黃色或棕色顆粒，CD44v6在癌旁組的陽性表達(dá)率為4.8%（3／62），在肺癌組中的陽性表達(dá)率為54.7%（64／117），肺癌組 CD44v6的陽性率顯著 高于癌旁組 （χ2＝42.642，P＝0.0001）；肝素酶表達(dá)于肺癌細(xì)胞質(zhì)，肝素酶在癌旁組的陽性表達(dá)率為17.7%（11／62），在肺癌組中肝素酶的陽性表達(dá)率為86.3%（101／117），肺癌組肝素酶的陽性率顯著高于癌旁組（χ2＝81.389，P＝0.000 1），見表1、圖1。

表1 CD44v6、肝素酶在肺癌及癌旁正常肺組織中的表達(dá)（n）

圖1 CD44v6、肝素酶在肺癌組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)×400）

表2 CD44v6與肝素酶在NSCLC TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系（n）

2.2 CD44v6與肝素酶在NSCLC中的表達(dá)與肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系 CD44v6和肝素酶的表達(dá)程度與NSCLC的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，CD44v6在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者中陽性表達(dá)率為61.7%（42／68），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者的陽性表達(dá)率為44.9%（22／49），兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝27.736，P＜0.05）；肝素酶在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者中陽性表達(dá)率為94.1%（64／68），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者的陽性表達(dá)率為75.5%（37／49），兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝8.352，P＝0.000 1），見表2。

2.3 CD44v6與肝素酶表達(dá)的相關(guān)性 通過Spearman相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD44v6與肝素酶在NSCLC中的表達(dá)存在顯著正相關(guān)（r＝0.894，P＜0.05），見表3。

表3 兩種蛋白在NSCLC中的表達(dá)相關(guān)關(guān)系（n）

3 討 論

作者既往的研究表明在非小細(xì)胞肺癌患者中，CD44高表達(dá)組的生存率明顯低于CD44低表達(dá)組，這個結(jié)果與其他學(xué)者的研究報道相接近［2－4］。在本研究中作者采用免疫組織化學(xué)檢測NSCLC患者肺癌組織及相關(guān)的癌旁組織中CD44v6的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CD44v6蛋白在癌旁正常肺組織中的陽性表達(dá)率明顯低于NSCLC組織，并且CD44v6在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者中陽性表達(dá)率顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者的陽性表達(dá)率，提示CD44v6可能與NSCLC的轉(zhuǎn)移具有一定的關(guān)系，既往文獻(xiàn)亦報道了CD44v6還與胃癌、大腸癌、乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)［5－9］，本研究結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似。CD44v6是黏附分子CD44家族的主要成員，在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中，CD44v6主要參與了腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，而黏附在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要的作用。

既往已有大量的文獻(xiàn)表明肝素酶在多種不同組織來源的惡性腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)，肝素酶是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一個能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的主要成分硫酸乙酰肝素糖蛋白（HSPG）糖鏈的內(nèi)源性糖苷酶，而HSPG是細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的主要成分，其主要生物功能是維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定，限制細(xì)胞的遷移及黏附，并且HSPG是構(gòu)成血管壁的主要成分，能夠維持血管壁結(jié)構(gòu)完整并支撐增殖遷移的內(nèi)皮細(xì)胞。既往的文獻(xiàn)報道肝素酶的表達(dá)水平與肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［10］，抑制肝素酶的活性，可顯著改善腫瘤患者的預(yù)后［11］。并且，既往的文獻(xiàn)報道，肝素酶在裂解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜時，可導(dǎo)致釋放多種細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，為腫瘤在轉(zhuǎn)移器官內(nèi)增殖提供血供［12］，抑制肝素酶活性，有效阻止腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移［13］，目前已有學(xué)者將肝素酶作為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)［14－17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中肝素酶的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常肺組織，并且肝素酶在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者中肝素酶的陽性率明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者，該結(jié)果與既往的文獻(xiàn)報道相一致，這個結(jié)果也說明肝素酶的表達(dá)水平越高，NSCLC的腫瘤細(xì)胞就越容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是腫瘤致死的主要原因，而腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程是多階段、多步驟、多因素參與的，首先腫瘤通過抑制黏附因子的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞容易從原發(fā)灶脫離，形成游離細(xì)胞并分泌各種多種酶（如金屬蛋白酶、肝素酶）破壞細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)；然后腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)黏附分子的表達(dá)（如CD44v6），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞錨定在靶器官的毛細(xì)血管壁上，并穿透血管壁進(jìn)入靶器官，形成新的轉(zhuǎn)移灶。腫瘤的轉(zhuǎn)移過程復(fù)雜，包含許多因素，轉(zhuǎn)移過程中有許多相對獨(dú)立的步驟，只要其中任何一個步驟受限，其轉(zhuǎn)移就不能實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中，CD44v6和肝素酶的表達(dá)具有相關(guān)性，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中這兩種分子過表達(dá)可能在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移上具有相輔相成的作用，因此在臨床上可以將CD44v6及肝素酶的表達(dá)作為NSCLC預(yù)后的指標(biāo)，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中。

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