應(yīng)用激光多普勒成像技術(shù)測量皮瓣成活面積的準(zhǔn)確性分析＊

王友彬 吳煥文 肖一丁 高春錦 劉雪華 趙 嶺 劉蘊(yùn)琦 王曉軍 馬雪梅

皮瓣成活面積的測量是皮瓣研究的重要內(nèi)容，其 測 量 方 法 有 紙 模 法［1，2］、照 片 圖 像 分 析法［3，4］等。隨著微循環(huán)測量技術(shù)的發(fā)展，人們開始研究根據(jù)組織循環(huán)血流狀況確定組織成活的測量方法［5］，但用微循環(huán)灌注量來評估皮瓣成活情況以及這種判斷結(jié)果是否與皮瓣的組織學(xué)成活狀況相符合的研究目前未見報道。本文通過激光多普勒成像（LDI）技術(shù)和紙模法測量皮瓣成活面積的比較以及皮瓣組織病理學(xué)分析，評估用LDI微循環(huán)灌注方法判斷皮瓣成活面積的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

雄性SD大鼠12只，體重250g-350g。大鼠在SPF級動物實(shí)驗室飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22℃-25℃，實(shí)驗過程中自由攝取飼料和飲水。

1.2 皮瓣手術(shù)方法

實(shí)驗大鼠采用10%水合氯醛（0.3ml／100g）腹腔注射麻醉后，將腹部剃毛并設(shè)計大小約6cm×9cm的皮瓣。術(shù)區(qū)消毒鋪巾，將皮瓣沿設(shè)計線切開，顯露雙側(cè)腹壁下淺動脈，結(jié)扎并切斷左側(cè)動靜脈，形成以右側(cè)腹壁下淺動脈為蒂的腹部擴(kuò)大皮瓣；用顯微血管夾阻斷皮瓣血供3h，恢復(fù)皮瓣血供后將皮瓣原位縫合；皮瓣下置相應(yīng)大小的硅膠片。術(shù)后第5天每只大鼠均采用LDI和紙模法測量皮瓣成活面積，觀察皮瓣邊緣組織病理學(xué)變化。術(shù)后切口及皮瓣用無菌敷料包扎保護(hù)。

1.3 皮瓣成活面積測量方法

1.3.1 LDI測量法：用激光多普勒血流儀（LDF，PeriScan PIM3，Perimed AB，Sweden）完成。皮瓣手術(shù)后第5天，大鼠按上述方法麻醉后仰臥固定，充分暴露皮瓣部位，測量時環(huán)境溫度保持在22-25℃。將LDF探頭置于皮瓣區(qū)上部，設(shè)定觀測范圍為11.0cm×7.5cm大小，包括皮瓣及周圍正常皮膚。對設(shè)定區(qū)域的皮膚血流灌注量進(jìn)行測量后，LDF自動報告測定范圍內(nèi)不同部位皮膚血流量數(shù)據(jù)及不同顏色的圖像。紅色代表皮瓣血流灌注量最大，黑色代表最小甚至沒有血流灌注，黃色和藍(lán)色介于二者之間。圖像顏色和皮瓣成活情況的關(guān)系是：紅色、黃色以及與二者相連的藍(lán)色區(qū)域視為皮瓣成活區(qū)，黑色視為皮瓣壞死區(qū)，藍(lán)黑交界處視為皮瓣成活與壞死分界線。根據(jù)該分界線用移動鼠標(biāo)在圖像上人工標(biāo)定皮瓣成活區(qū)（即紅、黃和相鄰部分藍(lán)色區(qū)域），其面積值由與LDF配套連接的計算機(jī)自動計算生成（圖1）。

1.3.2 紙模測定法：LDI測量完成后，肉眼觀察皮瓣成活區(qū)（微紅白色）和壞死區(qū)（黑灰色），將透明描摹紙覆蓋在皮瓣上，用有色筆在紙上描出皮瓣壞死和成活范圍（圖2），通過掃描儀（HP M1536dnf，深圳）將成活皮瓣范圍掃描成圖像，用與掃描儀配套的Acrobat 7.0分析軟件計算皮瓣成活面積。

1.4 皮瓣組織病理學(xué)分析

1.4.1 HE染色：于皮瓣邊緣，即成活區(qū)和壞死區(qū)交界處取1×1cm2大小組織塊，經(jīng)甲醛（10%）固定、包埋、切片后行常規(guī)HE染色。光鏡觀察皮瓣成活與壞死組織的病理學(xué)表現(xiàn)，以驗證皮瓣成活區(qū)標(biāo)定準(zhǔn)確性的組織學(xué)依據(jù)。

1.4.2 CD34染色：用于觀察皮瓣組織內(nèi)微血管形態(tài)。采用免疫組化Envision二步法，染色過程中設(shè)陽性及陰性對照。上述標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，徠卡切片機(jī)連續(xù)切片（厚5μm）。切片常規(guī)脫蠟、水化，經(jīng)H2O2處理，阻斷內(nèi)源性過氧化酶。用山羊血清（北京中衫金橋公司，批號ZLI-9056）封閉處理后，依次滴加CD34鼠抗人單克隆抗體（北京中衫金橋公司，批號ZM-0046）和Envision二抗 （丹麥Dako生物制品有限公司，批號K4001），DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。皮瓣成活面積測量結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩種測量方法的結(jié)果比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種測量方法皮瓣成活面積比較

LDI技術(shù)測得的成活皮瓣面積為（10.19±3.27）cm2，紙模測量法測得的成活皮瓣面積為（10.21±3.15）cm2。兩種方法測值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.29，P＞0.05）。但由于大鼠腹部立體結(jié)構(gòu)在紙模法測量時會對描繪圖形產(chǎn)生影響，而LDI技術(shù)測量時結(jié)果幾乎不受大鼠腹部立體結(jié)構(gòu)的影響，因此兩法劃定的皮瓣和存活區(qū)范圍有一定差異。

2.2 成活皮瓣邊緣組織HE染色和CD34染色結(jié)果

2.2.1 HE染色：成活皮瓣邊緣內(nèi)側(cè)均可見正常皮膚組織，而外側(cè)出現(xiàn)明顯炎性損傷組織，其真皮及皮下組織中有較多急性及慢性炎性細(xì)胞浸潤，伴血管擴(kuò)張充血，表皮角質(zhì)層剝離、棘層增厚以及局灶性壞死形成（圖3）。

2.2.2 CD34染色：成活皮瓣邊緣內(nèi)側(cè)正常皮膚和皮下組織內(nèi)微血管形態(tài)正常，血管腔多為類圓形；而外側(cè)多數(shù)微血管管腔擴(kuò)張、變形，部分血管閉塞，呈條索狀（圖4）。

［本文圖1-圖4見封2］

3 討 論

在進(jìn)行皮瓣研究時，皮瓣成活面積和成活率是重要的參考指標(biāo)［6］。為確定皮瓣的成活面積，一些研究者先用紙模記錄成活皮瓣的大小、形態(tài)，然后用面積分析軟件計算成活面積的大?。?，2］，這種方法的測定結(jié)果存在對成活情況判斷的主觀誤差。用數(shù)碼相機(jī)記錄皮瓣成活情況，然后用面積分析軟件計算成活面積較前者簡便［3，4］，但同樣存在對皮瓣成活情況判斷的主觀誤差。根據(jù)組織血供判斷皮瓣成活狀況并進(jìn)行成活面積測定比上述方法更準(zhǔn)確。隨著LDF的發(fā)展和普及，其在皮瓣成活情況監(jiān)測方面的應(yīng)用越來越受到重視［5］。

LDI系統(tǒng)由激光光源發(fā)射器、快速接收器以及分析軟件組成。激光被組織特別是組織血管中運(yùn)動的紅細(xì)胞散射，散射的光束因多普勒效應(yīng)產(chǎn)生一定的波長變化，通過對這些光束的接收分析，即可測出紅細(xì)胞的流動速度［7］。因此，LDI系統(tǒng)能較好地監(jiān)測皮瓣的微循環(huán)血流灌注，判斷皮瓣組織成活情況［8］，從而較準(zhǔn)確地測量和計算皮瓣成活面積。

本實(shí)驗結(jié)果顯示，用紙模法和LDI兩種方法測定皮瓣成活面積，其結(jié)果無顯著差異。但和紙模法相比，用LDI技術(shù)測量皮瓣成活面積是通過皮瓣組織血流確定的，與通過主觀判斷確定成活邊界的紙模法比較，測量結(jié)果更客觀。另外，皮瓣邊緣皮膚組織的HE和免疫組化染色顯示，成活皮瓣有正常的血管形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)，而壞死區(qū)組織呈現(xiàn)血管擴(kuò)張和管腔閉塞，皮膚組織炎性浸潤和局灶性壞死，不可能給予皮瓣組織正常血供。這與LDI顯示的壞死皮瓣局部血流量明顯低于成活皮瓣相一致，為LDI測量成活皮瓣面積提供了組織學(xué)依據(jù)，即根據(jù)LDI確定的皮瓣成活面積，與實(shí)際成活皮瓣范圍基本一致。采用LDI技術(shù)測量皮瓣成活面積的方法準(zhǔn)確可靠。

為保證LDI技術(shù)測量的準(zhǔn)確性，在用鼠標(biāo)劃定成活皮瓣范圍時還需仔細(xì)觀察皮瓣大體成活情況。因為LDI測定的是真皮下的血流，當(dāng)皮膚壞死變薄時，LDI圖像會因為深部正常組織的血流被測及而呈正常皮膚血流的顏色，從而產(chǎn)生較大的誤差。所以在操作時應(yīng)仔細(xì)觀察掃描光斑在皮瓣上的位置及其相對應(yīng)的圖像顏色，盡量使鼠標(biāo)劃定的顏色范圍與活體上真正成活皮瓣的面積一致。

1 Contaldo C，Harder Y，Plock J，et al.The influence of local and systemic preconditioning on oxygenation，metabolism and survival in critically ischaemic skin flaps in pigs［J］.J Plast Reconstr Aesthet Surg，2007，60（11）：1 182-1 192.

2 戚 征，高春錦，喬 群，等.高壓氧預(yù)處理促進(jìn)皮瓣成活的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2009，15（1）：46-48.

3 Beheshtian A，Demehri S，Kiumehr S，et al.ATP-sensitive potassium channels mediate the anti-ischemic properties of ischemic and pharmacologic preconditioning in rat random-pattern skin flap［J］.Ann Plast Surg，2006，57（1）：94-99.

4 Küntscher MV，Schirmbeck EU，Menke H，et al.Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model［J］.Plast Reconstr Surg，2002，109（7）：2 398-2 404.

5 Booi DI，Debats IB，Boeckx WD，et al.A study of perfusion of the distal free-TRAM flap using laser Doppler flowmetry ［J］.J Plast Reconstr Aesthet Surg，2008，61（3）：282-288.

6 劉雪華，楊瑞年，郭昆華，等.高壓氧對家兔隨意皮瓣血管內(nèi)皮生長因子和缺氧誘導(dǎo)因子的影響［J］.中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志，2008，15（4）：207-210.

7 Leutenegger M，Martin-Williams E，Harbi P，et al.Real-time full field laser Doppler imaging［J］.Biomed Opt Express，2011，2（6）：1 470-1 477.

8 Du Z，Zan T，Li H，et al.A study of blood flow dynamics in flap delay using the full-field laser perfusion imager［J］.Microvasc Res，2011，82（3）：284-290.