非受體型酪氨酸蛋白激酶介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的研究進(jìn)展＊

張偉金綜述 郭曉華審校

作為一層選擇性半透膜，內(nèi)皮細(xì)胞通過細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，構(gòu)成物質(zhì)交換的屏障，不僅為血流提供光滑的表面，還參與許多生理調(diào)節(jié)，包括免疫反應(yīng)、血管生成及組織體液的穩(wěn)態(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致屏障功能下降將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如蛋白滲出肺間質(zhì)引起肺水腫和肺部急性損傷等［1］。而非受體型酪氨酸蛋白激酶（Src）是最早發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸激酶之一，在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。目前對其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究是一大熱點，特別是其對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響引起了廣泛關(guān)注。本文就Src介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的研究進(jìn)展綜述如下。

1 Src蛋白的生化特性

1.1 Src家族

Src家族作為一種非受體酪氨酸激酶，一共有9個成員，其中Src、Fyn、Yes和Frk在機體所有細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，而Blk、Fgr、Hck、Lck和Lyn只在造血系統(tǒng)的細(xì)胞中表達(dá)，它們共同參與對細(xì)胞的存活、黏附、遷移等相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。

1.2 Src的結(jié)構(gòu)及其活性調(diào)節(jié)

Src蛋白家族的結(jié)構(gòu)基本類似，主要由6部分組成：（1）N-端含有豆蔻?；男蛄?，有助于介導(dǎo)其錨定在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)；（2）Src第三同源區(qū)（Src Homology 3，SH3），約由50個氨基酸殘基組成，通過脯氨酸與靶蛋白結(jié)合；（3）Src第二同源區(qū)（Src Homology 2，SH2），約由100個氨基酸殘基組成，專一識別并結(jié)合磷酸酪氨酸的一段短肽；（4）將SH2區(qū)及激酶區(qū)連接起來的區(qū)域，該區(qū)域與SH3區(qū)域結(jié)合［2］；（5）激酶域，含有正調(diào)節(jié)磷酸化位點Y416，約由230個氨基酸組成；（6）C端調(diào)節(jié)域，含有可與SH2區(qū)域結(jié)合的負(fù)調(diào)節(jié)磷酸化位點Y527，約由20個氨基酸組成［3］。

蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化是一種通過可逆共價修飾來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的方式，Src蛋白也不例外，通過SH2區(qū)和SH3區(qū)與其它區(qū)域結(jié)合，Src蛋白改變它的結(jié)構(gòu)并呈現(xiàn)不同的活性。當(dāng)SH2區(qū)與磷酸化的C末端第527位酪氨酸位點（Tyr527）結(jié)合時，SH3區(qū)隨即結(jié)合到富含脯氨酸的鏈接區(qū)，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，阻礙ATP與激酶區(qū)結(jié)合，使Tyr416不能自磷酸化而使Src失活；相反，如果Tyr416自磷酸化，則Src蛋白激活。因此，酪氨酸殘基的磷酸化與去磷酸化在調(diào)節(jié)酶活性中起重要作用［4］。

同時，Src蛋白活性還受其它酪氨酸的調(diào)節(jié)，C端Src激酶（C-terminal Src Kinase，CSK）以及與CSK同源的激酶（CSK Homology Kinase，CHK）都可使Tyr527磷酸化，而且CHK可通過共價鍵與自磷酸化區(qū)域形成復(fù)合體［5］。因此，CHK可降低Src蛋白的活性。并且，Src蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatases，PTPs）可使 C端酪氨酸去磷酸化，提高Src活性［6］。

2 Src介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變

內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的維持依靠多種因素共同作用，包括介導(dǎo)細(xì)胞跨膜運輸?shù)鞍椎恼{(diào)節(jié)以及細(xì)胞間的連接。細(xì)胞間連接很大程度上有賴于細(xì)胞間的黏附力和細(xì)胞骨架收縮所致的向心力之間的動態(tài)平衡。細(xì)胞間的連接包括緊密連接（Tight Junction，TJ）和 黏 附 連 接 （Adherence Junction，AJ）［7］，而向心力來源于 F-肌動蛋白（Filamemtous Actin，F(xiàn)-actin）與肌球蛋白的相互作用，當(dāng)F-actin形成的應(yīng)力纖維致收縮力大于黏附力時，則導(dǎo)致細(xì)胞的通透性增高。

TJ具有將內(nèi)皮細(xì)胞緊密聯(lián)合成整體的作用，由閉合蛋白，密封蛋白等與TJ蛋白-1和連環(huán)蛋白-a結(jié)合后交聯(lián)肌動蛋白。而AJ由鈣黏連蛋白和整合素組成，一方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣黏連蛋白通過與胞內(nèi)a-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白，以及P-120連環(huán)蛋白銜接，最終與肌動蛋白的骨架關(guān)聯(lián)；另一方面，整合素胞外區(qū)與細(xì)胞外基質(zhì)相連，內(nèi)部通過樁蛋白與肌動蛋白連接。Src不僅可使參與跨膜運輸?shù)牡鞍仔螒B(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時可使參與TJ、AJ的蛋白形態(tài)發(fā)生改變，降低黏附力，又可使應(yīng)力纖維形成增多，增加細(xì)胞間的收縮力，最終打破平衡，使細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙增大，造成血管通透性升高。

2.1 Src參與跨膜運輸

有被小窩（Coated Pits）作為一種跨膜運輸機器，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定、膽固醇的穩(wěn)態(tài)及運輸一些疏水物質(zhì)。當(dāng)配體與有被小窩處的受體結(jié)合后，網(wǎng)格蛋白聚集在膜的胞質(zhì)側(cè)，牽動質(zhì)膜凹陷，隨后被一種小分子GTP結(jié)合蛋白-發(fā)動蛋白（Dynamin）黏附纏繞，使小泡從質(zhì)膜脫下，有被小泡很快脫去包被變成無被小泡，隨后被運輸?shù)饺苊阁w降解，實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運［8］。微囊蛋白（Caveolin-1）是內(nèi)皮細(xì)胞胞膜上的一種整合膜蛋白，是形成有被小窩的主要成分，對物質(zhì)的轉(zhuǎn)運時相、內(nèi)皮的滲透起重要調(diào)節(jié)作用。Src磷酸化可引起Caveolin-1和Dynamin的共同組裝，啟動細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運［9］。Shajahan等［10］通過實驗證明，加入一種酪氨酸磷酸酶抑制劑Na3VO4可使Src誘導(dǎo)的Caveolin-1和Dynamin磷酸化增高，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有被小泡的轉(zhuǎn)運。說明Caveolin-1及Dynamin的磷酸化和去磷酸化是跨膜運輸?shù)臎Q定性因素。

2.1.1 Src蛋白與Caveolin-1間的關(guān)系：Caveolin-1蛋白作為有被小窩的主要組成部分，由兩端的胞質(zhì)區(qū)及中間的疏水區(qū)組成，N端含有3個Src的同源性酪氨酸磷酸化位點，該位點的磷酸化可促進(jìn)Caveolin-1蛋白形成多聚體，并且誘導(dǎo)有被小窩的形成以及膜內(nèi)轉(zhuǎn)運，其中Src第14位酪氨酸位點（Tyr14）的功能相當(dāng)關(guān)鍵。羧基端附近存在的半胱氨酸（Cys）可通過硫酯鍵被共價修飾上長鏈棕櫚基團(tuán)，一旦Cys殘基突變，Caveolin-1與Src的連接會受到影響，Tyr14磷酸化即不能進(jìn)行［11］。有研究表明，Caveolin-1與具有細(xì)胞信號傳導(dǎo)作用的Ras蛋白的相互作用能有效地促使有被小窩形成，同時Ras超家族成員Rab蛋白還參與脫包小泡的轉(zhuǎn)運，在細(xì)胞胞吞胞吐過程中參與囊泡的形成、運動、對接、融合；而促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPK）信號途徑的上游Src直接調(diào)控Ras激活，以及信號分子Raf蛋白、Mek蛋白和Erk蛋白激活，而抑制Src的調(diào)控途徑可能逆轉(zhuǎn)MAPK的部分生物學(xué)效應(yīng)［12］。

內(nèi)皮細(xì)胞通透性還受NO的調(diào)節(jié)，NO可通過激活黏附分子來穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用。Chen等［13］證明NO可誘導(dǎo)Src磷酸化，并且磷酸化下游分子Caveolin-1，導(dǎo)致內(nèi)皮型NO合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS）與Caveolin-1結(jié)合而抑制eNOS活性，使NO合成減少，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用。即NO與Src介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

2.1.2 Src蛋白與Dynamin間的關(guān)系：Dynamin的自我組裝及其活性的發(fā)揮依賴于Src對其磷酸化，缺乏Src磷酸化的Dynamin很難促進(jìn)其與Caveolin-1的結(jié)合，從而使膜內(nèi)轉(zhuǎn)運受到嚴(yán)重干擾。Mallozzi等［14］研究表明，細(xì)胞原癌基因表達(dá)蛋白c-Src激酶與突觸小泡相關(guān)突觸素蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可使Tyr273磷酸化，磷酸化的突觸素再磷酸化Dynamin-1，促進(jìn)Dynamin-1的自我組裝，同時發(fā)現(xiàn)GTP酶活性增強；而在過氧亞硝酸的硝化作用下，Dynamin發(fā)生去組裝及GTP酶活性下降而影響胞吐作用。促使Dynamin黏附于小泡瓶頸需要一些蛋白的輔助，它們通過SH3與Dynamin的脯氨酸結(jié)合，編碼高度保守的二聚體BAR區(qū)域（BAR domain），它們可結(jié)合于膜并介導(dǎo)囊泡的脫落。該區(qū)域的活性受控于SH3區(qū)域的結(jié)合，調(diào)控其失活或激活效應(yīng)［15］。

2.2 Src參與細(xì)胞間運輸

2.2.1 Src蛋白對肌動蛋白（Actin）的影響：Src蛋白導(dǎo)致Actin骨架的重構(gòu)途徑包括直接作用、依賴小G蛋白Rho介導(dǎo)纖絲狀F-actin形成應(yīng)力纖維以及細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］升高。

直接作用途徑：病毒癌基因表達(dá)v-Src蛋白在40℃時處于非活化狀態(tài)，而在34℃時活化并轉(zhuǎn)至質(zhì)膜內(nèi)側(cè)，參與Actin的重組裝及細(xì)胞遷移。其機制是v-Src蛋白的SH3或SH2區(qū)與Actin的應(yīng)力纖維結(jié)合，拆卸Actin束，使Actin的骨架發(fā)生變化，破壞細(xì)胞的連接及黏附，從而增加細(xì)胞間通透性。其中絲足體（Podosome）的形成是細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的標(biāo)志，Src蛋白激活后，磷酸化Rho家族GTP酶激活蛋白（p190Rho GTPase-Activating Protein，p190RhoGAP），再與Ras家族GTP酶激活蛋白（p190Ras GTPase-Activating Protein，p190RasGAP）結(jié)合，并激活p190RhoGAP，進(jìn)而瓦解肌動蛋白，形成附著于質(zhì)膜表面的絲足體結(jié)構(gòu)。

Rho介導(dǎo)F-actin形成應(yīng)力纖維途徑也扮演重要角色。Praveen等［16］指出，一種富含Cys的細(xì)胞外基質(zhì)酸性分泌蛋白（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine，SPARC）可通過降低Rho活性而使Src的Tyr416磷酸化水平升高，激活Src蛋白，導(dǎo)致Actin應(yīng)力纖維的形成受抑制，進(jìn)而阻斷細(xì)胞骨架的破壞，降低細(xì)胞間的通透性。

研究表明，血清中的降鈣因子（Caldecrin）可以通過抑制Src的磷酸化，阻斷破骨細(xì)胞的作用，降低細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］［17］。Src蛋白的磷酸化可增加［Ca2+］，引起F-actin周圍致密束的解散，而整個過程又可能與蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）通路有密切關(guān)系。Li等［18］指出，PKC通路可通過磷酸化Src來活化Src，并推測磷酸化Src可能使［Ca2+］升高而激活PKC，形成級聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)Actin的解散。2.2.2 Src蛋白對局部黏著斑激酶（Focal Adhesion Kinase，F(xiàn)AK）的影響：v-Src蛋白誘導(dǎo)的黏著斑瓦解是一個依賴于鈣蛋白酶的降解過程。FAK的N端與整合素的β亞基連接，C端連接黏著斑靶向序列（Focal Adhesion Targeting Sequence，F(xiàn)AT），從而穩(wěn)固細(xì)胞間的連接。一旦FAK被Src磷酸化后，就會失去銜接功能，使下游通路中斷，導(dǎo)致細(xì)胞間隙增大。

絲裂原磷酸化蛋白（Disabled 2，DAB2）在人內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，作為一種接頭蛋白，通過抑制Src-FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能及通透性。敲除DAB2的細(xì)胞則會刺激Src-FAK通路，通過磷酸化FAK的Y925誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞骨架破壞，增加細(xì)胞通透性［18］。有研究［19］顯示，在內(nèi)皮細(xì)胞中，X染色體相關(guān)的凋亡蛋白抑制劑（X-Chromosome Linked Inhibitor of Apoptosis Protein，XIAP）可抑制細(xì)胞黏附與遷移，它可能通過FAK磷酸化調(diào)節(jié)FAK活性，而敲除XIAP的細(xì)胞則使Src刺激下的Tyr576磷酸化作用降低，并誘導(dǎo)FAK轉(zhuǎn)入核內(nèi)，從而降低Src與FAK的相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞間黏著斑瓦解，細(xì)胞間通透性增高。

2.2.3 Src蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏著蛋白（Vascular Endothelial Cadherin，VE-cadherin）的影響：在緩激肽或組胺的刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，此時發(fā)現(xiàn)Src蛋白發(fā)生磷酸化，并通過VE-cadherin Y658和Y685磷酸化，使VE-cadherin泛素化，介導(dǎo)細(xì)胞間黏附降低，通透性增高。運用Src抑制劑可以阻止VE-cadherin的Y658磷酸化，即使用緩激肽刺激也不能使細(xì)胞通透性升高［20］。進(jìn)一步實驗表明，應(yīng)用Src同源的酪氨酸磷酸酶 （Src Homology 2-Domain Containing Tyrosine Phosphatase，SHP2）可介導(dǎo) VE-cadherin作用的恢復(fù)，即在凝血酶刺激導(dǎo)致VE-cadherin重組裝情況下，SHP2可通過使VE-cadherin相關(guān)的β-catenin去磷酸化而使VE-cadherin形態(tài)得到恢復(fù)；而采用SHP2抑制劑則促使Src對Cadherin磷酸化、VE-cadherin的恢復(fù)明顯降低，導(dǎo)致細(xì)胞屏障功能受損［21］。

研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor2，VEGFR2）能與T細(xì)胞特定調(diào)節(jié)因子（T Cell-Specific Adaptor，TSAd）的SH2區(qū)結(jié)合，使c-Src的Y418磷酸化，Y527去磷酸化，從而活化c-Src激酶，激發(fā)下游通路，破壞VE-cadherin結(jié)構(gòu)；而敲除TSAd基因小鼠的通透性改變不大［4］。提示Src介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性調(diào)節(jié)需要TSAd基因參與。Spring等［22］認(rèn)為密度增強的蛋白酪氨酸磷酸酶-1（Density Enhanced Protein Tyrosine Phosphatase-1，DEP-1）能通過與Src的SH2區(qū)結(jié)合，磷酸化Src以及使Y527去磷酸化，增加Src活性，磷酸化的Src與底物VE-cadherin的緊密結(jié)合，可介導(dǎo)通透性的升高；而有趣的是，在開始用VEGF誘導(dǎo)Src蛋白磷酸化時，即使高表達(dá)DEP，Src蛋白的Y418也會發(fā)生去磷酸化，從而使Src蛋白失活，并使下游通路阻斷，內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低，但這種情況隨著時間的推移會逐漸緩解。

3 展望

綜上所述，Src通過復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，作用于細(xì)胞連接相關(guān)的骨架蛋白，影響細(xì)胞連接的結(jié)構(gòu)與功能的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞間隙增大，使血管的通透性增加。因此Src蛋白將會成為治療相關(guān)疾病的新靶點，而在診斷疾病的過程中，Src蛋白也有助于對患者病情進(jìn)行評估，從而在臨床上發(fā)揮重要的指導(dǎo)作用。

1 Maniatis NA，Kardara M，Hecimovich D，et al.Role of caveolin-1 expression in the pathogenesis of pulmonary edema in ventilatorinduced lung injury［J］.Pulm Circ，2012，2（4）：452-460.

2 Giannoni E，Taddei ML，Chiarugi P，et al.Src redox regulation：again in the front line［J］.Free Radic Biol Med，2010，49（4）：516-527.

3 Roskoski RJ.Src protein-tyrosine kinase structure and regulation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，324（4）：1 155-1 164.

4 Sun Z，Li X，Massena S，et al.VEGFR2induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd［J］.J Exp Med，2012，209（7）：1 363-1 377.

5 Okada M.Regulation of the SRC family kinases by Csk［J］.Int J Biol Sci，2012，8（10）：1 385-1 397.

6 Byeon SE，Yi YS，Oh J，et al.The role of Src kinase in macrophage-mediated inflammatory responses［J］.Mediators Inflamm，2012，2012：512926.

7 Agrawal T，Sharvani V，Nair D，et al.Japanese encephalitis virus disrupts cell-cell junctions and affects the epithelial permeability barrier functions［J］.PLoS One，2013，8（7）：e69 465.

8 Sorrentino V，Nelson JK，Maspero E，et al.The LXR-IDOL axis defines a clathrin-，caveolae-，and dynamin-independent endocytic route for LDLR internalization and lysosomal degradation［J］.J Lipid Res，2013，54（8）：2 174-2 184.

9 Huang WR，Wang YC，Chi PI，et al.Cell entry of avian reovirus follows a caveolin-1-mediated and dynamin-2-dependent endocytic pathway that requires activation of p38mitogen-activated protein kinase（MAPK）and Src signaling pathways as well as microtubules and small GTPase Rab5protein［J］.J Biol Chem，2011，286（35）：30 780-30 794.

10 Shajahan AN，Timblin BK，Sandoval R，et al.Role of Src-induced dynamin-2phosphorylation in caveolae-mediated endocytosis in endothelial cells［J］.J Biol Chem，2004，279（19）：20 392-20 400.

11 Dietzen DJ，Hastings WR，Lublin DM，et al.Caveolin is palmitoylated on multiple cysteine residues.Palmitoylation is not necessary for localization of caveolin to caveolae［J］.J Biol Chem，1995，270（12）：6 838-6 842.

12 Kline CL，Olson TL，Irby RB，et al.Src activity alters alpha3 integrin expression in colon tumor cells［J］.Clin Exp Metastasis，2009，26（2）：77-87.

13 Chen Z，Bakhshi FR，Shajahan AN，et al.Nitric oxide-dependent Src activation and resultant caveolin-1phosphorylation promote eNOS／caveolin-1binding and eNOS inhibition［J］.Mol Biol Cell，2012，23（7）：1 388-1 398.

14 Mallozzi C，D＇Amore C，Camerini S，et al.Phosphorylation and nitration of tyrosine residues affect functional properties of Synaptophysin and Dynamin I，two proteins involved in exo-endocytosis of synaptic vesicles［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1833（1）：110-121.

15 Neumann S，Schmid SL.Dual role of BAR domain-containing proteins in regulating dynamin-2catalyzed vesicle release［J］.J Biol Chem，2013，288（35）：25 119-25 128.

16 Bhoopathi P，Gondi CS，Gujrati M，et al.SPARC mediates Srcinduced disruption of actin cytoskeleton via inactivation of small GTPases Rho-Rac-Cdc42［J］.Cell Signal，2011，23（12）：1 978-1 987.

17 Tomomura M，Hasegawa H，Suda N，et al.Serum calcium-decreasing factor，caldecrin，inhibits receptor activator of NF-kappaB ligand （RANKL）-mediated Ca2+signaling and actin ring formation in mature osteoclasts via suppression of Src signaling pathway［J］.J Biol Chem，2012，287（22）：17 963-17 974.

18 Orlandini M，Nucciotti S，Galvagni F，et al.Morphogenesis of human endothelial cells is inhibited by DAB2via Src［J］.FEBS Lett，2008，582（17）：2 542-2 548.

19 Ahn S，Park H.XIAP is essential for shear stress-enhanced Tyr-576phosphorylation of FAK［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，399（2）：256-261.

20 Orsenigo F，Giampietro C，F(xiàn)errari A，et al.Phosphorylation of VE-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo［J］.Nat Commun，2012，3：1208.

21 Timmerman I，Hoogenboezem M，Bennett AM，et al.The tyrosine phosphatase SHP2regulates recovery of endothelial adherens junctions through control of beta-catenin phosphorylation［J］.Mol Biol Cell，2012，23（21）：4 212-4 225.

22 Spring K，Chabot C，Langlois S，et al.Tyrosine phosphorylation of DEP-1／CD148as a mechanism controlling Src kinase activation，endothelial cell permeability，invasion，and capillary formation［J］.Blood，2012，120（13）：2 745-2 756.