PCR 技術(shù)在快速檢測食源性致病菌中的應(yīng)用

何維鳳

（廣西南寧市邕寧區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530299 E－mail：524417747＠qq.com）

隨著生活水平的提高，食品安全問題受到人們越來越多的重視，已經(jīng)成為社會關(guān)注的熱點之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，2005年世界范圍內(nèi)有150萬人死于腹瀉等疾病，其中有70%為食源性因素造成［1］。在我國食源性疾病暴發(fā)事件中，微生物性食物中毒的暴發(fā)事件數(shù)和患者數(shù)最多，占總數(shù)的40.09%和61.92%［2］，食源性微生物是導(dǎo)致食源性疾病的主要原因。傳統(tǒng)的檢測方法繁瑣復(fù)雜、周期較長，不能實現(xiàn)有效的監(jiān)測、預(yù)防作用，因此快速而準(zhǔn)確地檢測與鑒定食品中的病原菌是及時有效控制和預(yù)防病原菌傳播、預(yù)防食物中毒的重要前提。

PCR 技術(shù)即 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)（polymerase chain reaction）是1985 年創(chuàng)立的一種體外酶促擴增特異性片段的方法。該技術(shù)自問世以來，就以驚人的速度廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域。目前在食品領(lǐng)域中致病微生物、轉(zhuǎn)基因食品的檢測等方面的應(yīng)用也越來越受關(guān)注。筆者對PCR 技術(shù)在食源性致病菌快速檢測中的應(yīng)用綜述如下。

1 單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測

李斯特菌廣泛存在于自然界中。目前國際上公認(rèn)的李斯特菌屬共有6個種，即單核細(xì)胞增多性李斯特菌、伊萬諾夫李斯特菌（又稱為綿羊李斯特菌）、英諾克李斯特菌、威爾斯李斯特菌、西爾李斯特菌和格氏李斯特菌。其中在李斯特菌屬的分類種中，單核細(xì)胞增生李斯特菌（簡稱單增李氏菌）對人類致病性最強，是一種重要的食源性致病菌，它能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多等，因此，李斯特菌的檢測也受到越來越多的關(guān)注。譚炳乾等［3］采用PCR 擴增單核細(xì)胞增生李斯特菌的溶血素LLO 編碼基因（hly）片段的方法，檢測81份冷凍食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌，結(jié)果與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法一致；馮家望等［4］通過建立多重—巢式PCR 聯(lián)合檢測體系快速檢測食品中單增李斯特菌，結(jié)果多重PCR 的靈敏度達(dá)到1×102cfu／ml，巢式PCR 的靈敏度達(dá)到1×10cfu／ml，對6類冷凍冷藏食品3 439份樣品中的單增李斯特菌進(jìn)行檢測，結(jié)果準(zhǔn)確，同時有效縮短了檢驗周期。王耀等［5］應(yīng)用復(fù)合PCR 結(jié)合變性高效液相色譜（DHPLC）技術(shù)建立食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌、綿羊李斯特菌和英諾克李斯特菌的快速高通量檢測方法，為預(yù)防李斯特菌食源性疾病的暴發(fā)和流行起到了積極的作用。

2 金黃色葡萄球菌的檢測

金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的主要病原菌，也是化膿感染最常見的病原菌之，由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒、肺炎、心包炎和腦膜炎甚至敗血癥等相關(guān)疾?。?］。從臨床分離金黃色葡萄球菌，約1／3產(chǎn)生腸毒素，而且該腸毒素在100 ℃條件下經(jīng)過30min熱處理仍能保持致病性。萬婧等［7］選用金葡菌的腸毒素A 基因與金葡菌的種特異性基因nuc作為靶標(biāo)設(shè)計特異性引物，建立水產(chǎn)品中金色葡萄球菌的雙重PCR－DHPLC方法，檢測240份樣品，結(jié)果與國標(biāo)法無顯著性差異，同時通過對腸毒素基因的分析，判斷出該菌株致病性的強弱；蘇明權(quán)等［8］根據(jù)金黃色葡萄球菌femB 基因序列設(shè)計引物和探針建立實時熒光定量PCR 檢測金黃色葡萄球菌的方法，檢測20 份模擬樣品，結(jié)果與分離培養(yǎng)符合率為100%；楊玉軍等［9］利用多重PCR 擴增金黃色葡萄球菌SEA、SEB、SEC 和SED 基因片段的方法，同時檢測金黃色葡萄球菌四型腸毒素基因，比傳統(tǒng)PCR 方法省時省力，可以彌補傳統(tǒng)PCR法的不足，為快速檢測產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌及追蹤金黃色葡萄球菌食物中毒的源頭提供一種檢測手段。

3 蠟樣芽孢桿菌的檢測

蠟樣芽孢桿菌是一種革蘭陽性桿菌，能形成芽孢，在周圍環(huán)境中廣為存在，為條件致病菌，極易污染食物而引起食物中毒，因此需要發(fā)展一種快速的檢測方法，把危險菌株從非致病性的菌株中區(qū)別開來，如果是傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，整個過程可能要5～7d 的時間，對于食物中毒可疑因子的判斷及患者的及時治療影響很大，因此及時快速準(zhǔn)確的檢測方法應(yīng)運而生。王振國等［10］以cereolysin AB基因為目的基因設(shè)計引物建立SBYR Green l的實時PCR 方法，其最低檢出限可達(dá)8CFU／ml，且無需電泳可直接對樣品進(jìn)行檢測；王紅等［11］以溶血素（HBL）基因和非溶血素（NHE）基因為目的基因進(jìn)行熒光PCR 檢測，檢測34株蠟樣芽孢桿菌溶血素基因，符合率97.1%，從樣品的處理到結(jié)果的報告耗時僅為2～3h，較傳統(tǒng)方法大大縮短了檢測周期，為及時處理食物中毒贏取寶貴的時間。

4 沙門氏菌的檢測

沙門氏菌是感染人和動物的重要病原菌之一，常污染肉、乳和禽等動物性食品，人體會因為直接接觸沙門氏菌或食用被其污染的食物而感染，引起腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀，嚴(yán)重的可引起死亡。在世界各國的各類細(xì)菌性食物中毒事件中，由沙門氏菌引起的食物中毒常居榜首［12］，目前傳統(tǒng)的檢測方法費時繁瑣，需4～7d才能完成，因此PCR 技術(shù)成為沙門氏菌檢測研究的熱點。鐘偉軍等［13］根據(jù)編碼鼠傷寒沙門氏菌腸毒素stn基因的核苷酸序列設(shè)計1對引物和熒光探針，建立了熒光定量PCR快速檢測食品中沙門氏菌的方法，具有較高的特異性和敏感性；周曉清等［14］選取沙門氏菌的invA 基因為目的基因設(shè)計引物建立一步法逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 檢測食源性沙門氏菌，該方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點，檢測人工污染豬肉中的沙門氏菌與微生物傳統(tǒng)計數(shù)結(jié)果的符合率為100%，并可在5h內(nèi)完成所有操作，非常適用于食源性沙門氏菌的快速檢測。

5 志賀氏菌的檢測

志賀氏菌屬是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，俗稱痢疾桿菌，可通過水和食物傳播腹瀉和痢疾等疾病，嚴(yán)重危害人們的身體健康，建立志賀氏菌快速準(zhǔn)確、實用的檢測方法尤為重要。邱楊等［15］根據(jù)志賀氏菌ipaH 基因序列設(shè)計了特異引物和探針進(jìn)行熒光PCR，檢測樣品437份，檢測結(jié)果與國標(biāo)法一致；趙麗華等［16］根據(jù)ipaH 基因序列，設(shè)計引物和分子信標(biāo)探針，建立志賀氏菌的實時PCR 快速檢測技術(shù)，檢測20份標(biāo)本，準(zhǔn)確率和特異性均為100%，時間約2h，大大縮短了檢測周期，可用于志賀氏菌食物中毒快速診斷和食品微生物檢測，為食源性疾病的早期、準(zhǔn)確診斷提供新的檢測手段。

6 致病性大腸桿菌的檢測

大部分大腸桿菌是人或動物腸道里的共生菌，但其中也有部分菌株可引起腹瀉等疾病［17］，致瀉大腸桿菌不但可引起傳染性疾病而且可引起食源性疾病的暴發(fā)，因此建立快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測方法非常重要。鄭桂麗等［18］針對大腸桿菌O157 特異基因rfbO157設(shè)計引物進(jìn)行PCR，特異性強，靈敏度高，可在3～4h 內(nèi)完成對O157的檢測，O157 的臨床早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種較好的手段。胡慧等［19］針對大腸桿菌O157：H7的特異基因rfbE 設(shè)計一對特異引物，建立SYBR Green Ⅰ實時定量PCR 檢測方法，結(jié)果顯示所建立的SYBR Green Ⅰ實時定量PCR 方法可以快速、特異地檢測出大腸桿菌O157：H7，細(xì)菌純培養(yǎng)物中其靈敏度可達(dá)2×10cfu／ml，臨床模擬污染肉樣中能最低能檢測到1×102cfu／ml的大腸桿菌O157：H7。臨床檢測肉樣500份，檢測靈敏度高于常規(guī)PCR；徐義 剛 等［20］通 過ETEC LT 基 因、EPEC bfpA 基 因、EHECO抗原基因和EIEC 侵襲性質(zhì)?；蛐蛄?，設(shè)計了4對特異性引物，建立了致腹瀉性大腸桿菌多重PCR－DHPLC 檢測方法，達(dá)到同時檢測4 種致病菌的目的；林杰等［21］利用多重PCR 同時檢測5種致瀉性大腸桿菌8種毒力基因的方法，取得較好的效果。因此多重PCR 的出現(xiàn)達(dá)到快速、高通量檢測病原微生物的目的。

7 副溶血性弧菌的檢測

副溶血性弧菌又稱為嗜鹽菌，不耐熱，是一種嗜鹽性革蘭氏陰性致病弧菌，常存在于近海水、海產(chǎn)品、鹽漬食品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌。人食用污染有該菌的海產(chǎn)品后可引起急性胃腸炎，嚴(yán)重時還可引起敗血癥，其引發(fā)的食源性疾病已成為當(dāng)前全球面臨的公共衛(wèi)生問題之一。目前，采用MPN 法對食品中的副溶血弧菌進(jìn)行檢測，此方法需要3～7d的時間，且容易出現(xiàn)交叉污染和假陽性。近年來已有林強等［22］以toxR 作為靶基因設(shè)計特異性引物及TaqMan探針建立熒光定量PCR 方法，檢測178份牡蠣樣品，檢測到陽性樣品168份，最低檢測濃度為10cfu／g，最高檢出濃度為318 180 cfu／g，靈敏度高于MPN 培養(yǎng)檢測法；俞春松［23］選取副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素基因作為檢測的靶片段設(shè)計引物及探針，建立檢測副溶血性弧菌的熒光定量PCR，檢測方法靈敏度為10cfu／ml，檢測20份樣本，結(jié)果符合常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果；王小玉等［24］根據(jù)副溶血性弧菌種特異性基因不耐熱溶血毒素基因tl和直接耐熱溶血素毒素基因tdh建立熒光PCR 方法，檢測方法靈敏度達(dá)10cfu／reaction。該方法大大縮短了檢測過程，只需要1h左右，這是包括細(xì)菌分離、常規(guī)PCR 在內(nèi)的其它方法所無法比擬的。而且該方法選擇了種特異性基因和毒力基因，能夠鑒別出分離菌株是否是副溶血性弧菌并進(jìn)一步判別是否潛在致病，為多重?zé)晒釶CR 檢測副溶血性弧菌的研究奠定了基礎(chǔ)。

8 霍亂弧菌的檢測

霍亂為危害嚴(yán)重的夏秋季急性腸道傳染病，迄今仍然是發(fā)展中國家面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一。目前我國霍亂雖已得到有效控制，但發(fā)生或流行的潛在威脅依然存在。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷是及時控制霍亂疫情蔓延的關(guān)鍵。黃世旺等［25］根據(jù)霍亂毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守區(qū)域設(shè)計特異性引物與TaqMan探針，建立特異、靈敏、快速的Taq Man熒光定量PCR 方法用于快速檢測霍亂弧菌，檢測靈敏度達(dá)10 cfu／ml，整個操作過程僅需2h。用該方法檢測24份臨床腹瀉樣本，準(zhǔn)確率100%，因此該方法可用于霍亂弧菌的日常監(jiān)測和暴發(fā)疫情的應(yīng)急診斷。杜聯(lián)峰等［26］根據(jù)霍亂毒素ctxA、toxR、O139 群特異性基因、O1 群特異性基因序列設(shè)計特異性引物進(jìn)行多重PCR，建立了穩(wěn)定可靠的霍亂弧菌多重PCR 檢測平臺；覃倚瑩等［27］分別以rfbM 和wbfR 基因作為O1和O139群霍亂弧菌的模板設(shè)計引物和探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了能夠同時檢測O1群O139群霍亂弧菌的二聯(lián)實時熒光定量PCR 方法（FQ－PCR）。用該方法對10份模擬食品樣品和133份臨床樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，該方法特異性為100%；O1群霍亂弧菌和O139群霍亂弧菌檢出限分別為92cfu／ml和116cfu／ml；另外該方法對模擬樣品和臨床樣品檢測結(jié)果與國標(biāo)法的檢測結(jié)果完全一致，符合率為100%。因此該實時熒光PCR 檢測方法能夠同時檢測O1和O139群霍亂弧菌，而且特異性好、靈敏度高，能有效克服假陽性，適用于基層疾病控制、口岸檢疫單位日常疫情監(jiān)測和臨床診斷。

綜上所述，食源性致病菌檢測在引入PCR 技術(shù)后得以迅速發(fā)展，從最初的普通PCR，到各種改良技術(shù)的運用，再到熒光實時定量PCR 的出現(xiàn)，多種、多重PCR 的綜合應(yīng)用已成為一種趨勢，其高特異性、高敏感度和簡便快速，為食物中毒和食源性疾病暴發(fā)的應(yīng)急處置提供了依據(jù)。今后，隨著經(jīng)濟(jì)社會的不斷發(fā)展，必然會對食源性致病菌的檢測提出越來越高的要求，而隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信會有更多快速、簡便、特異的檢測技術(shù)得到應(yīng)用，必定對人類公共衛(wèi)生、食品安全、營養(yǎng)健康與疾病控制等作出巨大貢獻(xiàn)。

［1］ WHO.Food safety and foodbome illness ［EB／OL］.www.who.int／med iac entre／factsheets／fs237／en／，2008.A ccessed September，22，2008.

［2］ 龐璐，張哲，徐進(jìn).2006－2010年我國食源性疾病暴發(fā)簡介［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2011，23（6）：560－563.

［3］ 譚炳乾，肖軍.PCR 在快速檢測食品單核細(xì)胞增李斯特菌中的應(yīng)用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（7）：1558－1560.

［4］ 馮家望，吳小，王小，等.多重－巢式PCR 檢測食品中單增李斯特菌研［J］.中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2007，30（1）：56－59.

［5］ 王耀，曹際，閆平平，等.食品中3種致病李氏菌MPCRDHPLC檢測方法的建立［J］.食品科學(xué)，2010，31（8）：158－162.

［6］ 朱穗京，金黃色葡萄球菌感染及治療現(xiàn)狀研究進(jìn)展［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，34（2）：223－224.

［7］ 萬婧，周向陽，張曉峰，等.雙重PCR－DHPLC 技術(shù)快速檢測水產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌［J］.食品科學(xué)，2013，34（6）：199－203.

［8］ 蘇明權(quán)，楊柳，馬越云，等.實時熒光定量PCR 檢測金黃色葡萄球菌方法的試驗研究［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（8）：794－796.

［9］ 楊玉軍，黃韋唯，王志云，等.多重PCR 快速檢測金黃色葡萄球菌四型腸毒素基因的研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36（9）：1713－1715.

［10］ 王振國，劉金華，徐寶梁，等.應(yīng)用實時熒光PCR 檢測致病性蠟樣芽孢桿菌［J］.生物技術(shù)通訊，2006，17（1）：40－42.

［11］ 王紅，唐振柱，黃彥，等.熒光檢測蠟樣芽孢桿菌及溶血素基因應(yīng)用研究［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2011，33（7）：885－887.

［12］ 世界衛(wèi)生組織.食品安全和食源性疾?。跡B／OL］.（2007－03）.http：／／www.who.int／mediacentre／factsheets／fs237／zh／index.html.

［13］ 鐘偉軍，趙明秋，鄧中平，等.熒光定量PCR 快速檢測食品中沙門氏菌方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008，30（3）：220－224.

［14］ 周曉清，李苗云，劉杰，等.一步法逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測食源性沙門氏菌［J］.食品科學(xué)，2013，34（12）：182－188.

［15］ 邱楊，唐麗霞，趙麗，等.志賀氏菌實時熒光PCR 檢測試劑的研制［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（11）：1151－1154.

［16］ 趙麗華，周勇，萬成松.分子信標(biāo)PCR 檢測志賀菌ipaH基因［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2006，6（5）：499－502.

［17］ Vidal M，Kruger E，Duran C，et al.Single multiplex PCR assay to identify simultaneously the six categories of diarrheagenic Escherichia coli associated with enteric infections［J］.J Clin Microbiol，2005，43（10）：5362－5365.

［18］ 鄭桂麗，廖紹安，李釧華，等.大腸桿菌O157特異基因的PCR 檢測方法［J］.中國衛(wèi) 生 檢驗雜志，2005，15（10）：1183－1185.

［19］ 胡慧，陳雅君，段志剛，等.大腸桿菌O157：H7特異基因的實時熒光定量PCR 檢測［J］.食品科學(xué)，2011，32（12）：278－282.

［20］ 徐義剛，崔麗春，李蘇龍，等.多重PCR－DHPLC 檢測4種主要致腹瀉性大腸埃希氏菌方法的建立與應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2010，31（20）：293－297.

［21］ 林杰，陳愛平，楊勁松，等.檢測致瀉大腸桿菌的多重PCR 方法的建立與應(yīng)用［J］.預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2012，18（12）：881－884.

［22］ 林強，李寧求，付小哲，等.牡蠣中副溶血弧菌熒光定量PCR 檢測方法的建立及其應(yīng)用［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2011，18（1）：96－102.

［23］ 俞春松.熒光定量PCR 檢測食品中副溶血性弧菌方法的建立［J］.中國高等醫(yī)學(xué)教育，2010（5）：144－145.

［24］ 王小玉，馮家望，吳小倫，等.實時熒光PCR 方法檢測副溶血性弧菌的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（6）：135－138.

［25］ 黃世旺，盧亦愚，徐丹戈，等.TaqMan熒光定量PCR 技術(shù)快速檢測霍亂弧菌方法的建立［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（8）：923－924.

［26］ 杜聯(lián)峰，楊澤，余妍，等.霍亂弧菌多重檢測方法的建立及優(yōu)化［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，37（1）：101－102，104.

［27］ 覃倚瑩，吳暉，肖性龍，等.Taq－Man實時熒光定量PCR同時檢測O1和O139群霍亂弧菌［J］.衛(wèi)生研究，2010，39（1）：101－105.