膠原蛋白的應(yīng)用研究及存在的問題

王艷芳，李世財(cái)，劉亞林，張 玲，李清梅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，130033；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，130033)

1.膠原蛋白基因的來源及結(jié)構(gòu)特征

1.1 膠原蛋白的來源

據(jù)科學(xué)研究膠原蛋白是肉食性動(dòng)物特有的蛋白質(zhì)，是動(dòng)物體內(nèi)含量較高的一種蛋白質(zhì)，廣泛的分布在動(dòng)物的結(jié)締組織中，也是人體內(nèi)蛋白質(zhì)的重要組成部分，約占人體蛋白質(zhì)的三分之一。畜禽類動(dòng)物一直是人們獲取天然膠原蛋白的主要途徑，但由于近些年各種疾病的出現(xiàn)使人們對(duì)陸生動(dòng)物膠原蛋白及其制品的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑，因此人們將開發(fā)膠原蛋白的目光轉(zhuǎn)向了海洋生物。我們都知道地球百分七十是海洋，并且海洋生物資源豐富，而在許多海洋生物中各種魚類膠原蛋白含量都比較高，尤其是海洋生物加工廢棄物--皮、骨、鱗中所含有的膠原蛋白。食品科學(xué)雜志報(bào)道了一種提取牛皮中膠原蛋白的新方法--酸酶復(fù)合法,該法工藝簡單,在相對(duì)較短的制備時(shí)間內(nèi),膠原蛋白的提取率可達(dá)54.5%，在食品工業(yè)科技上報(bào)道用酶解法提取安康魚中的膠原蛋白的平均提取率達(dá)11.01%，純度可達(dá)96.5%，熱力法提取魚鱗膠原蛋白含量達(dá)45.74%，大連工業(yè)學(xué)報(bào)上記載用熱水法提取鱈魚膠原蛋白的最優(yōu)提取率可達(dá)83.75%[1]。

1.2 膠原蛋白基因的結(jié)構(gòu)

近些年隨著DNA 重組技術(shù)、DNA 探針的出現(xiàn)使人們對(duì)膠原蛋白基因有了初步研究,人們開始了探索膠原蛋白基因結(jié)構(gòu)的旅途，并獲得了一些它們?cè)谌旧w上的定位資料。目前知道已有4 種膠原基因都含有一個(gè)TATA 序列,位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5'端20-30b 處。E.Avvedimento,Y.Yamada 及M.Mudryj 等人對(duì)膠原蛋白基因的某些表達(dá)子的大小及一級(jí)結(jié)構(gòu)等特性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明: 表達(dá)子的大小有明顯的保守性,12 個(gè)表達(dá)子中有四個(gè)大小相同(5 4 堿基對(duì)),2 個(gè)表達(dá)子由108 個(gè)堿基對(duì)組成,恰是54 的二倍。值得指出的是, 雖然大多數(shù)表達(dá)子長度相同(54 個(gè)堿基對(duì)),但除了甘氨酸的密碼子(GGx)每隔二個(gè)三體碼出現(xiàn)一次外,表達(dá)子內(nèi)的核普酸序列不盡相同。另一個(gè)特點(diǎn)是, 所有的表達(dá)子的堿基對(duì)數(shù)都是9 的倍數(shù), 這是因?yàn)闉楸３秩菪倪B續(xù)性, 只有缺失9 個(gè)堿基對(duì)或是9 的倍數(shù)才是可行的,確實(shí)膠原蛋白分子的基本重 復(fù)單位qly - x -y 是由9 個(gè)堿基所編碼[2]。而I 型膠原蛋白的基因長約4okb，包含52個(gè)外顯子，編碼的單體肽鏈包含1464 個(gè)氨基酸殘基。單體的膠原多肽鏈由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體所合成，其前體a 鏈上含有1 個(gè)22 氨基酸殘基的信號(hào)肽序列，該信號(hào)肽序列為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號(hào)肽受體所識(shí)別，在一些移位子的幫助下可穿過ER 膜進(jìn)入ER 腔中，前體鏈上的信號(hào)肽被ER 腔中的信號(hào)肽酶切割形成原膠原的單體分子結(jié)構(gòu)。原膠原分子在分泌出細(xì)胞之前，在ER中還要經(jīng)歷一系列翻譯后的修飾過程。據(jù)報(bào)道新合成的原膠原多肽鏈進(jìn)入ER 腔以后至少受到9 種分子伴侶與酶的作用。多肽鏈中的脯氨酸與賴氨酸要被脯氨酸3 位羥化酶、脯氨酸4 位羥化酶及賴氨酸4 位羥化酶有選擇性地羥基化，這3 種酶都需要鐵離子、2-酮戊二酸、分子氧以及抗壞血酸作為其輔助因子。I 型原膠原蛋白分子中大約有50%的脯氨酸殘基在4 位含有1個(gè)羥基，脯氨酸的羥基化程度有種屬的差異，生活在低溫環(huán)境中的動(dòng)物，其膠原蛋白上的脯氨酸羥基化程度較低，脯氨酸的羥基化對(duì)于原膠原單體之間形成氫鍵是必需的，因而對(duì)于膠原三螺旋結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性具有相當(dāng)大的作用[3]。

2.膠原蛋白的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

膠原蛋白屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，呈白色，含有豐富的氨基酸--甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和谷氨酸（Glu）等18 種氨基酸，特別是甘氨酸含量最高，約占總氨基酸的27%，且每隔兩個(gè)氨基酸殘基（X，Y）即有一個(gè)甘氨酸，故其肽鏈結(jié)構(gòu)可用（Gly-X-Y）n 來表示，還含有在其它生物體內(nèi)少見的羥脯氨酸。膠原蛋白是由3 條α 鏈多肽組成,每一條鏈都是左手螺旋構(gòu)型,3 條左手螺旋鏈又相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu),即超螺旋結(jié)構(gòu)，使其蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。常見類型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型，因其各種類型膠原蛋白具有良好的生物性能，因此在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域被廣泛的應(yīng)用。

3.膠原蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)室中大腸桿菌是基因表達(dá)的重要工具，將膠原蛋白基因運(yùn)用基因手段使其在大腸桿菌中表達(dá)，收獲的膠原蛋白含量可觀，并且運(yùn)用大腸桿菌做宿主的遺傳背景相對(duì)比較清楚，表達(dá)易于控制，且大腸桿菌易于培養(yǎng)，可以獲得較高產(chǎn)量的膠原蛋白[4]。早在1980 年，Uit toJ 等就從人的皮膚細(xì)胞體外培養(yǎng)中獲得到了Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白。1997 年，在芬蘭Oulu 大學(xué)膠原蛋白研究中心在研究人的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原蛋白全序列的畢赤酵母表達(dá)中取得較大的成功。經(jīng)過大量研究表明了膠原蛋白與脯氨酸羥化酶在宿主細(xì)胞的共表達(dá)是一個(gè)很好的策略。1999 年BruinEC 等人使用漢森酵母和畢赤酵母作為宿主，表達(dá)人類Ⅰ型膠原蛋白的肽鏈，并做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)使用膠原蛋白自身的信號(hào)肽能使?jié)h森酵母表達(dá)并分泌重組蛋白，卻不能使畢赤酵母分泌重組膠原蛋白。NokelainenM 等人使用兩種桿狀病毒轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)類人特異性軟骨膠原Ⅱ型，表達(dá)出具有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)的蛋白,產(chǎn)量達(dá)到50mg/mL。通過DD-PCR 得到人I 型膠原蛋白基因。該基因的讀碼框長4395bp,編碼1464 個(gè)氨基酸,編碼蛋白分子量約139.01kD。該基因在胃癌及食管癌組織中的表達(dá)量高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織,并且在食管癌組織中的表達(dá)差異較胃癌中更明顯。人I 型膠原蛋白基因在胃癌及食管癌中均呈高表達(dá),推測其可能在胃癌及食管癌的發(fā)生發(fā)展中起作用[5]。

4.膠原蛋白的相關(guān)產(chǎn)品及應(yīng)用

隨著人們對(duì)膠原蛋白需求量的逐漸增多，提取膠原蛋白的方式已經(jīng)不能滿足日益增長的膠原蛋白市場的需求，于是新的生產(chǎn)膠原蛋白的方法-生物反應(yīng)器，不僅滿足了人們對(duì)膠原蛋白量的需求而且更加安全可靠，從而使膠原蛋白在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

4.1 食品產(chǎn)業(yè)

民以食為天，我們就先來探討一下膠原蛋白在食品領(lǐng)域的重要應(yīng)用。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),其分子在細(xì)胞外基質(zhì)中聚集為超分子結(jié)構(gòu)。含有人體內(nèi)重要的必需氨基酸和非必需氨基酸如甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸等，因此對(duì)人體有重要的作用。

4.1.1 肉制品和肉制品的包裝材料

膠原蛋白的水解產(chǎn)物-明膠，通過破壞膠原蛋白分子間的氫鍵，使其原有的超螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，形成結(jié)構(gòu)較為松散的小分子。加入肉制品中可以改善結(jié)締組織的嫩度，使其具有良好的品質(zhì),增加蛋白質(zhì)的含量。并且添加在肉質(zhì)食品中色澤鮮艷，易于被消費(fèi)者所接受。因其具有緊密的螺旋結(jié)構(gòu)，從而顯示出很強(qiáng)的韌性和強(qiáng)度，氨基酸組成又使其具有優(yōu)良的成膜能力。這些有利條件促成了其在食品包裝材料中的應(yīng)用?？芍瞥傻娜忸?、魚類的包裝紙、涂抹層及可食包裝膜，具有良好的抗拉強(qiáng)度、熱封性、阻氣、阻油、阻濕性，可防止食品吸潮或干縮變形[6-7]。

4.1.2 冷凍食品

小孩經(jīng)常吃的果凍、雪糕、冰激凌等食品中即是以膠原蛋白為膠凍劑，具有熔點(diǎn)低、入口即化的特點(diǎn)，因此可做為冷凍食品的改良劑，避免食品氧化、抑制褐變反應(yīng)。

4.1.3 飲料、酒類食品

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道飲料、酒類食品的澄清劑，大多是膠原蛋白制成的，在發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用尤為廣泛，特別是作為發(fā)酵后期除去酒中的一些膠體懸浮物的最佳澄清劑。魚膠是國際上公認(rèn)的高級(jí)澄清劑, 在啤酒和葡萄酒行業(yè)中取得十分好的效果，產(chǎn)品質(zhì)量也非常穩(wěn)定。在果酒釀造過程中也起到增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、澄清劑等作用。在茶飲料的生產(chǎn)中，明膠又可防止茶飲料長期存放引起的混濁，改善茶飲料品質(zhì)的目的。

4.1.4 保健食品

膠原蛋白能夠?yàn)槿梭w膠原蛋白的合成提供優(yōu)質(zhì)的氨基酸原料，尤其是脯氨酸和羥脯氨酸，促進(jìn)膠原蛋白的合成，及時(shí)補(bǔ)充人體皮膚流失的膠原蛋白，有助于維持皮膚中膠原蛋白的特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到改善皮膚水分，延緩皮膚衰老的作用。目前，以膠原蛋白為主要原料開發(fā)的保健食品日益受到廣泛的認(rèn)可，更高層次的符合了現(xiàn)代人“從內(nèi)到外”對(duì)美麗的追求[8]。

5.2 化妝品上的應(yīng)用

膠原蛋白作為一種新型的化妝品原料，對(duì)人體皮膚和毛發(fā)均有較好護(hù)理效果。許多高檔化妝品中都添加有膠原蛋白，它為皮膚提供必需的營養(yǎng)成分，補(bǔ)充多種氨基酸，加強(qiáng)了皮膚的活性，保持角質(zhì)層水分以及纖維結(jié)構(gòu)的完整性，改善皮膚細(xì)胞生存環(huán)境和促進(jìn)皮膚組織的新陳代謝。市面上含膠原蛋白的化妝品品牌Col ly Pink、派高、HR 眼霜和面霜、SISLEY 膠原蛋白霜、DR.CILABO 海洋膠原蛋白霜、HR 赫蓮娜膠原蛋白、活膚乳液Avon、雅芳青春養(yǎng)顏潔面乳、Avon 雅芳青春養(yǎng)顏除皺精華、貝健魚蛋白片、全金膠原蛋白粉、建泰爾膠原蛋白等。由于膠原及其水解物與人皮膚膠原的結(jié)構(gòu)相似，相容性好，可以擴(kuò)散到皮膚的深層，對(duì)人的皮膚有很好的營養(yǎng)作用，且膠原蛋白分子外側(cè)存在大量的羧基和羥基，同時(shí)存在大量的甘氨酸等天然保濕因子，能提高組織細(xì)胞的貯水能力，使皮膚保濕；許多種膠原蛋白多肽與皮膚細(xì)胞的生長、分化、分裂、增殖有關(guān)，能提供皮膚的養(yǎng)分，延緩皮膚衰老，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)；膠原蛋白溶液還有很強(qiáng)的抗輻射作用，因而廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)[9-11]。

4.3 生物醫(yī)學(xué)材料

近些年膠原蛋白廣泛的應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)材料中，用膠原蛋白制成的膠原蛋白海綿、絲線和薄膜，主要用于外科止血，在皮膚醫(yī)學(xué)上膠原蛋白制成的傷口敷料和人工皮膚用于傷口愈合，血管和心瓣膜用于心臟外科手術(shù)，膠原蛋白膜用于口腔外科、促進(jìn)牙周鍵膜再生和口腔吸收性覆料，藥物投遞輔助機(jī)制用于生長素、生化大分子和質(zhì)體基因投遞工具;膠原蛋白基質(zhì)膜板用于植入細(xì)胞作為組織、器官再生的模板。

4.4 制藥領(lǐng)域

屬于藥物輸送系的干擾素緩釋藥劑和性器官疵癥治療緩釋劑，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療用藥、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物由乳中生產(chǎn)人類膠原蛋白用以調(diào)制藥劑，膠原蛋白發(fā)酵制成的降血壓劑；組織工程用膠原蛋白制成人工皮膚、人工食道、人工器官、燒傷保護(hù)膜等；人工骨即在骨生長因子中混合膠原蛋白膜、組織與骨修復(fù)用膠原蛋白和骨骼修復(fù)劑；膠原蛋白藥劑也可制成膀胱失禁用藥；美容外科用膠原蛋白整形。

5.膠原蛋白的發(fā)展前景

膠原蛋白作為一種天然的生物資源，具有高分子材料無法比擬的生物相容性和可降解性，廣泛的應(yīng)用在食品、醫(yī)學(xué)、保健和化妝品等領(lǐng)域中。隨著我國科技進(jìn)步、經(jīng)濟(jì)發(fā)展及人民生活水平的提高，對(duì)于外在美和內(nèi)在美越來越重視，人們將焦點(diǎn)聚集到了膠原蛋白上。對(duì)膠原蛋白及其制品的深入研究和生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn), 越來越多膠原蛋白產(chǎn)品將滿足人們的不同需求, 特別是用在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的膠原蛋白制品將會(huì)不斷出現(xiàn)。膠原蛋白將會(huì)更廣泛地造福人類，成為人們?nèi)粘Ｉ畈豢苫蛉钡囊徊糠帧?/p>

6.膠原蛋白目前在表達(dá)和應(yīng)用上存在的問題

隨著膠原研究領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多不同類型的膠原。這些膠原蛋白都有獨(dú)特且重要的生物功能，為人類提供重要各種產(chǎn)品，同時(shí)由于不同膠原蛋白基因的突變也引起了的人類疾病的劇增。盡管研究工作已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但許多問題，如除常見的幾種膠原蛋白外其他類型膠原的結(jié)構(gòu)和功能、控序列，明膠結(jié)構(gòu)的基本特性和膠原-明膠的轉(zhuǎn)化，膠原蛋白的調(diào)控序列具體過程等目前還無法回答。

6.1 表達(dá)上的問題

膠原蛋白基因的表達(dá)是其本身的順式作用元件、反式作用元件以及諸多調(diào)控因子相互作用的結(jié)果。并且?guī)讉€(gè)膠原蛋白的第一個(gè)內(nèi)含子都含有調(diào)控序列。膠原蛋白基因的表達(dá)是其本身的順式作用元件、反式作用因子以及諸多調(diào)控因子相互作用約結(jié)果。在眾多的調(diào)控因子中,ILJ、TGF-β、肝纖維化因子等屬于正調(diào)節(jié)因子，能夠刺激膠原基因的轉(zhuǎn)錄；而γ-INF、PGE2 固醇類激素等屬于負(fù)調(diào)節(jié)因子，在一定程度上抑制了膠原基因的轉(zhuǎn)錄；但對(duì)于膠原蛋白的各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控因子的作用機(jī)制及其轉(zhuǎn)錄機(jī)制和速度等問題有待進(jìn)一步研究[12]。對(duì)I 型膠原蛋白基因的功能、I 型膠原蛋白基因在其他惡性腫瘤中是否也高表達(dá)以及在胃癌及食管癌中具體通過何種途徑發(fā)揮促癌作用等方面進(jìn)行的深入研究,將會(huì)有利于解析腫瘤形成、發(fā)展的機(jī)制，從而從根本上解決癌癥問題。

6.2 應(yīng)用上的問題

膠原蛋白其實(shí)就是一種蛋白質(zhì)，被分解為氨基酸后，其膠原蛋白的形態(tài)和結(jié)構(gòu)已不復(fù)存在，也不可能直接以膠原蛋白的形式補(bǔ)充到皮膚中，因此開發(fā)一種承載膠原蛋白的載體已成為研究膠原蛋白藥物應(yīng)用的當(dāng)務(wù)之急。由于膠原蛋白熱使有些廠家在膠原蛋白類食品、化妝品、藥物方面大做文章，對(duì)消費(fèi)者造成一定影響，再加在利潤的誘惑下使有些商家在提取膠原蛋白工藝上偷工減料，使其產(chǎn)生一些有害的物質(zhì)，對(duì)人們身體健康造成了很大的影響。因此對(duì)膠原蛋白知識(shí)的普及應(yīng)該得到重視[13]。

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