纖維素酶的研究現(xiàn)狀與前景

張 雋

（哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150025）

0 前言

纖維素是自然界中分布最為廣泛的生物資源，我國每年產(chǎn)生的纖維素資源總量超過15億噸。但是，由于降解工藝的不成熟，成本過高等問題的存在，限制了纖維素的應(yīng)用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可再生能源的應(yīng)用成為了研究的熱點。纖維素最為自然界中數(shù)量最為龐大的可再生資源將會成為能源，化工領(lǐng)域的重要原材料。同時，纖維素資源的有效利用對于解決世界能源危機，糧食短缺問題和環(huán)境污染問題有著重要意義。

纖維素廣泛分布于植物體之中，纖維素是植物細(xì)胞壁構(gòu)成的主要成分，占植物干重約三分之一到三分之二。但是大量的纖維素只有一小部分被用于人類的日常生產(chǎn)生活中，絕大多數(shù)都通過微生物分解等途徑回歸到自然界的碳循環(huán)中。

纖維素是一種多糖，是以纖維二糖為基本單位，由許多β-D-葡萄糖分子以β-（1，4）糖苷鍵連接而成的高分子聚合物。纖維素分子羥基上的氫與相鄰羥基上的氧之間可以形成氫鍵。纖維素分子之間存在的氫鍵力使其在常溫下比較穩(wěn)定。纖維素的大分子間形成氫鍵的多少、強弱不同，形成了結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)。每個氫鍵的引力雖然很?。?0.9～33.5kJ/mol），但由于氫鍵很多，所以總的引力很大（共價鍵336～378kJ/mol氫鍵 21.0～33.6 kJ/mol范德華力 8.4～12.6kJ/mol）。 因而天然纖維素傾向于纏繞在一起，形成了結(jié)晶狀不溶性的剛性結(jié)構(gòu)。以致密的晶體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了化學(xué)試劑或者生物酶與纖維素表面的有效接觸和作用，因此造成了天然纖維素非常的難水解。但是纖維素非常容易被纖維素酶水解，所以纖維素酶降解纖維素的研究成為纖維素應(yīng)用領(lǐng)域研究的重點。

纖維素酶不是單一的酶，是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用，分解纖維素產(chǎn)生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖。

1 纖維素酶系的組成

纖維素酶是一種多成葡萄糖[1]，它包括內(nèi)切葡聚糖酶（CMC）、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶(BG)。內(nèi)切酶分子量在23kD-146kD，外切酶在38kD-118kD，纖維二糖酶大部分大于70kD，有的少于400kD。在它們相互協(xié)同作用下纖維素可以降解纖維素生成葡萄糖。下面對三種酶進行簡單介紹：

1.1 內(nèi)切葡聚糖苷酶（CMC酶）

酶解主要產(chǎn)物是纖維糊精、纖維二糖和纖維三糖。CMC酶隨機地水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈的纖維素分子截短變成許多纖維素末端。它主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)和一些可溶性的底物如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素。同時，它也可以將小分子的纖維素寡糖水解。值得注意的是，它不能降解結(jié)晶區(qū)的纖維素。

1.2 外切葡聚糖苷酶（CBH酶）

CBH酶在天然纖維素的降解過程中起到很重要的作用。它水解β-1，4糖苷鍵，每次作用只切下一個纖維二糖分子。和CMC酶不同的是CBH酶可以作用于纖維素分子的結(jié)晶區(qū)、無定形區(qū)以及羧甲基纖維素。有實驗發(fā)現(xiàn)了另一種酶，它們先從還原性末端將纖維二糖切下，可以看出自然界中存在兩類CBH酶，分別從還原端和非還原端水解纖維素分子。

1.3 纖維二糖酶（BG酶）

它水解纖維二糖和較短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，是一種非專一性酶，可以水解多種β-糖苷鍵。纖維二糖抑制纖維素酶的反饋作用，而BG酶可以減輕這種抑制從而加快反應(yīng)速度，所以有人提出纖維二糖酶不屬于纖維素酶的說法。

目前認(rèn)為，纖維素完全降解成葡萄糖至少需要以上三種功能不同但又互補的纖維素酶組分協(xié)同作用才能完成[2]。

2 纖維素酶的活性特點及分子結(jié)構(gòu)

Tilbeugh等對纖維素酶拆分研究發(fā)現(xiàn)，降解纖維素的酶是由約56KD球狀的纖維素催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domains，CD或 core protein，CP）、氨基酸序列較為保守但沒有催化作用纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cellulose-Binding Dom sins，CBD)和高度糖基化的連接肽-連接橋（Linker）三部分組成[3]。

2.1 催化結(jié)構(gòu)域

它是由α/β組成的筒狀結(jié)構(gòu)：由5個α螺旋和7條β鏈組成，活性部位是由兩個延伸至表面的環(huán)（loop）所形成一個隧道狀（tun-nel）結(jié)構(gòu)，長度大約2nm，包含4個結(jié)合位點，水解糖苷鍵的反應(yīng)發(fā)生在第2和第3結(jié)合位點之間。研究表明，這種隧道結(jié)構(gòu)，可以連續(xù)催化完成幾個糖苷鍵的斷裂反應(yīng)。纖維素酶屬于糖基水解的大家族，跟其他糖基水解酶的不同之處在于它的催化結(jié)構(gòu)域能夠水解葡萄糖殘基之間的 β-1，4 糖苷鍵。

2.2 纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域

相對于催化結(jié)構(gòu)域來說，不同微生物來源的纖維素酶在這一部分差別較大，不同微生物來源的纖維素酶，其CBD在酶分子一級結(jié)構(gòu)的氨基酸肽鏈上的位置會有不同，多數(shù) CBD位于酶序列的C-末端或N-末端，少數(shù)位于中間。CBD部分氨基酸同源性在不同微生物類群間差異較大，同一種微生物不同纖維素酶CBD的氨基酸序列具有同源性，不同種類微生物纖維素酶CBD的氨基酸序列同源性較小。真菌CBD的序列之間有更多的相似性，真菌和細(xì)菌之間還沒有發(fā)現(xiàn)明顯的序列同源性。對真菌和細(xì)菌纖維素酶的CBD三維結(jié)構(gòu)的解析表明，真菌CBD由33-36個氨基酸組成，且具有高度的同源性；而細(xì)菌由100-110個氨基酸組成，同源性較低。真菌的外切酶的CBD的結(jié)構(gòu)呈楔型，一面親水，另一面疏水，且親水面結(jié)中只有3個Tyr芳香族氨基酸執(zhí)行吸附纖維素的功能。細(xì)菌外切酶的CBD很大，包含很多芳香族氨基酸，其中的 Trp54和 Trp72暴露于酶蛋白分子表面，執(zhí)行吸附功能。

CBD主要維持酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性使纖維素酶結(jié)合于纖維素表面，使得臨近的催化域易于接近底物促進底物的水解.CBD的存在對于外切葡聚糖酶的識別底物及催化尤為重要。缺少CBD的酶能聚集成多酶復(fù)合物并由其中某特定非催化組分介導(dǎo)而結(jié)合纖維素。

2.3 連接橋

纖維素酶復(fù)合物的催化結(jié)構(gòu)域CD與纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBD之間通過一段相當(dāng)長、高度糖基化的連接肽連接，在一級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)該區(qū)域富含脯氨酸和羥脯氨酸。細(xì)菌纖維素酶linker富含Pro和Thr，完全由Pro-Thr這樣的重復(fù)順序組成，而真菌的纖維素酶linker富含Pro、Ser和Thr，并且數(shù)量上比細(xì)菌的少，僅有30-40個氨基酸殘基，而細(xì)菌的則約由100個氨基酸殘基組成。由于纖維素酶復(fù)合物的連接肽常暴露于水相，對蛋白酶又非常敏感，所以，這段肽鏈也常常被O-gly-cosilated糖基化防止被蛋白酶水解。不同纖維素酶linker的糖鏈及其糖基化程度不同，并且糖基化也不是纖維素酶活力所必需的。連接肽的作用可能是保持CD和CBD之間的距離，有助于不同酶分子間形成較穩(wěn)定的聚集體。

3 纖維素酶的作用機制

纖維素底物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了纖維素作用機的多樣性，同時作用的底物均為不溶性的纖維素，所以它的作用機理比可溶性物質(zhì)為底物的酶復(fù)雜了很多，闡明纖維素酶的作用機理同樣也就變得困難了一些。纖維素酶的作用機理主要與纖維素酶的組成部分、活性特點、分子結(jié)構(gòu)、及其作用底物的性質(zhì)等多方面因素相關(guān)。將天然纖維素水解為葡萄糖是先從內(nèi)切葡聚糖酶開始的：內(nèi)切葡聚糖酶首先會在纖維素分子鏈上一些相對比較比較薄弱的位置上作用，打開分子鏈，將結(jié)晶纖維素水解成無定形纖維素和可溶性低聚糖，然后外切葡聚糖酶斷開纖維素分子鏈中的氫鍵，這時會產(chǎn)生很多纖維素片段，纖維素分子被分解為纖維素二糖和纖維三糖等，其作用很可能是從微晶纖維素中使纖維素鏈脫離解聚，釋放游離端。最終內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖酶將這些纖維素片段斷開變成單個的葡萄糖分子。BG酶一般不直接作用于纖維素，而是通過降解內(nèi)切酶和外切酶的水解產(chǎn)物，最終產(chǎn)生葡萄糖，而消除纖維二糖對纖維素降解的抑制作用，因此它成為將纖維素快速降解的一類酶。由此可知，內(nèi)切葡聚糖酶 （CMC）、外切葡聚糖酶（CBH）、葡萄糖苷酶（BG）在作用機制上是不具有絕對專一性的，在功能效果上也不同，但是值得肯定的是在纖維素降解成葡萄糖的過程中使通過他們之間的協(xié)同作用完成的，若將各種纖維素酶組分按照一定質(zhì)量比例混合，可發(fā)生最大的協(xié)同水解作用。

4 纖維素的應(yīng)用

4.1 在食品工業(yè)方面的應(yīng)用

如果在大豆制醬的加工過程中利用用纖維素酶進行脫皮，在提高產(chǎn)品質(zhì)量的同時又大大降低了成本，也可以用于從大豆和葉子中提取蛋白質(zhì)和淀粉類物質(zhì)；用纖維素酶還可以提高面制品的烘焙和營養(yǎng)的品質(zhì)，延長保質(zhì)期。果蔬中含有大量纖維素，如果使用傳統(tǒng)的方法進行加工會破壞口感、流失營養(yǎng)，但如果采用纖維素酶處理會使植物組織軟化利于被人體吸收，因此采用食品級采用酶制劑對水果進行有效的降解，增加了果汁的產(chǎn)率，改善產(chǎn)品顏色和提高了其穩(wěn)定性。

4.2 在釀造、發(fā)酵工業(yè)方面的應(yīng)用

纖維素酶應(yīng)用在啤酒發(fā)酵中，在少量的大麥發(fā)芽中加入纖維素酶，能夠有效降解 β-1，3-糖苷鍵和 β-1，4-糖苷鍵，因此幫助了大麥發(fā)芽，此外纖維素酶還可以降解酒糟，增加啤酒的過濾效率。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，因此纖維素酶直接作用于植物細(xì)胞壁，可以在食醋發(fā)酵過程中提高反應(yīng)速度，主產(chǎn)物的出產(chǎn)量也會提高。

4.3 在飼料工業(yè)方面的應(yīng)用

纖維素酶可用于多種纖維素質(zhì)原料的糖化處理，纖維素酶添加量通常在0.1%-0.3%就能夠分解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的纖維素，課用于生產(chǎn)蛋白飼料，增加了飼料的來源。纖維素酶可以把飼料中不易被消化的纖維素降解為糖和菌體蛋白，提高了飼料的利用率及其利用價值，同時能夠增加動物的食欲，加速動物的生長發(fā)育。因此研究開發(fā)纖維素酶飼是應(yīng)用纖維素酶的一個重要領(lǐng)域。

4.4 在其他工業(yè)方面

用纖維素酶適當(dāng)處理紙漿，能增加微細(xì)纖維生成量和提高保水度，有可能提高紙張的抗張力；利用纖維素酶對纖維織物進行生物整理，經(jīng)纖維素酶整理的織物具有滑爽、布面清晰、懸垂性好、吸濕性強等特點，并具有一定的絲光效果；纖維素酶在草藥提取方面也有一定應(yīng)用。

5 展望

纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為糖僅僅是個開始，還要將葡萄糖轉(zhuǎn)化為其他附加值較高的產(chǎn)物，如乙醇和有機酸物質(zhì)，在這個過程中的一個關(guān)鍵步驟是纖維基質(zhì)的預(yù)處理，可以降低生產(chǎn)成本、增加原料利用率。纖維素酶種類繁多，來源很廣，不同來源的纖維素酶的結(jié)構(gòu)和功能存在很大的差異，雖然還需要漫長的研究過程但是值得肯定的是其作用范圍相當(dāng)廣泛。

［1］曹健.里氏木霉纖維素酶的純化和性質(zhì)[J].食品科學(xué),2003(5)：72-74.

［2］林風(fēng).纖維素酶的生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究進展[J].生命科學(xué),1994,6(1)：18-23.

［3］Hanlin R.Microcycle conidiation-a review[J].Myco science,1994,35(1)：113-123.