LC-MS法測(cè)定大鼠血漿中EXH-1626的濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究

李泰平，肖 紅，向 華

0 引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來，乳腺癌發(fā)病正日漸年輕化，已嚴(yán)重影響婦女的身心健康及生命安全，因此，研制有效安全、毒副作用小的新型抗乳腺癌藥物顯得尤為迫切。EXH-1626是中國(guó)藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室合成的一種新型6-芳基茚并異喹啉酮衍生物，藥效學(xué)研究表明其可以用于治療乳腺癌，其分子式為C29H28N2O3。茚并異喹啉酮類化合物是美國(guó)國(guó)立癌癥研究中心(NCI)通過COMPARE系統(tǒng)比較篩選而得到的一類新型拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，與喜樹堿類化合物相比，茚并異喹啉酮類化合物沒有內(nèi)酯環(huán)，因而在體內(nèi)表現(xiàn)出更好的化學(xué)穩(wěn)定性[1]。關(guān)于EXH-1626在生物樣品中的測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道較少[2]，本試驗(yàn)旨在建立一種測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高、可操作性強(qiáng)的液相色譜-質(zhì)譜法，并應(yīng)用于EXH-1626的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，為其非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑 EXH-1626鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品(由中國(guó)藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供，批號(hào)：20100927，純度99.2%)；卡馬西平(中國(guó)藥品生物制品檢定所，0142-9503)；純凈水(杭州娃哈哈純凈水公司)；甲醇、乙腈(色譜純，TEDIA公司)；蛋白沉淀劑(甲醇∶5%硫酸鋅=70∶30，V/V)；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器 Agilent 6410型三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀與1200型液相色譜系統(tǒng)，均為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，包括ESI離子化源，MassHunter B.03.01(數(shù)據(jù)采集與定性)和MassHunter B.04.00(數(shù)據(jù)分析)處理軟件，Binary SL四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器以及柱控溫箱。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為ODS C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，漢邦公司；流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L醋酸銨水溶液(乙酸調(diào)pH至3)(70∶30)；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI)；SIM檢測(cè)方式；干燥氣溫度為350 ℃；干燥氣流速為10 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化器壓力為40 psi；定量分析的離子[M+H]+分別為m/z 453.3(EXH-1626)，碰撞能160 V；m/z 237.1(內(nèi)標(biāo))，碰撞能130 V；掃描時(shí)間為20 ms。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.2.1 EXH-1626標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取EXH-1626標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，得1.0 mg/mL貯備液，然后依次加水稀釋配成100 000、50 000、10 000、5 000、1 000、500、200、100和50 ng/mL EXH-1626標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取5.8 mg卡馬西平于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，即配制成58 mg/mL卡馬西平儲(chǔ)備液。取一定量的卡馬西平儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋至100 μg/mL作為內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)血樣的制備 取離心管數(shù)支，分別精密加入不同量的EXH-1626標(biāo)準(zhǔn)液后以氮?dú)饬鞔蹈?，加入空白血漿200 μL，渦旋1 min，配成血漿中含EXH-1626分別為5、10、20、50、100、500、1 000、5 000和10 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，同法依次配成血漿中含EXH-1626分別為10、100、1 000和10 000 ng/mL的由低到高濃度的質(zhì)量控制(QC)血樣。

2.3 血漿樣品的處理 精密量取血漿樣品200 μL于空白離心管中，精密加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(100 μg/mL)，渦旋混勻后再精密加入蛋白沉淀劑200 μL，渦旋1 min，混勻后離心(12 000 r/min) 10 min，吸取上清液至分析小瓶中，進(jìn)樣5 μL分析。

2.4 藥代動(dòng)力學(xué) Sprague-Dawley大鼠16只，清潔級(jí)，體重(200±20) g，由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2008-0004。隨機(jī)分4組，每組4只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。口服實(shí)驗(yàn)，取兩組大鼠稱重后按80和250 mg/kg的劑量灌胃給予EXH-1626混懸溶液(用純凈水配制)，于給藥前以及給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h，由大鼠斷尾采血0.4 mL。靜脈實(shí)驗(yàn)，另取兩組大鼠按10和20 mg/kg劑量尾靜脈注射給予EXH-1626葡萄糖溶液(用5%葡萄糖溶液配制并滅菌處理)，于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48和72 h，由大鼠斷尾取血0.4 mL左右。血樣均置于預(yù)先肝素化的試管中，經(jīng)12 000 r/min離心10 min后分離血漿，-20 ℃保存待測(cè)。所得的血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)應(yīng)用中國(guó)藥科大學(xué)生物利用度研究數(shù)據(jù)處理通用程序BAPP2.2軟件計(jì)算EXH-1626的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 方法的專屬性 在本實(shí)驗(yàn)所采用的條件下，EXH-1626和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.9和3.5 min左右。如圖1所示，EXH-1626和內(nèi)標(biāo)峰形良好，能有效分離，無雜峰干擾測(cè)定，專屬性良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾EXH-1626和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。EXH-1626及內(nèi)標(biāo)的一級(jí)掃描質(zhì)譜圖，見圖2。

圖1 空白血漿、EXH-1626及卡馬西平的典型色譜圖

圖2 EXH-1626(A)及內(nèi)標(biāo)(B)的一級(jí)掃描質(zhì)譜圖

3.2 線性范圍和定量限 按“2.2.3”項(xiàng)下操作配制系列血藥濃度為5、10、20、50、100、500、1 000、5 000和10 000 ng/mL的樣品，按“2.3”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，建立EXH-1626的標(biāo)準(zhǔn)曲線。EXH-1626濃度(ng/mL)為縱坐標(biāo)，以y表示，EXH-1626峰面積(As)與內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)的比值(As/Ai)為橫坐標(biāo)，以x表示，線性回歸計(jì)算得回歸方程為y=101.13x-34.55(r=0.999 7，權(quán)重系數(shù)為1/c2)，EXH-1626血漿濃度在5～10 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限濃度為5 ng/mL(S/N>10)。

3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 以空白血漿配制由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個(gè)不同濃度的EXH-1626 QC樣品，每一濃度進(jìn)行5份樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，將QC樣品的結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個(gè)不同濃度的日內(nèi)、日間精密度分別為8.7%、4.4%、4.3%、1.1%和7.4%、4.1%、4.0%、1.4%，符合生物樣品分析方法的要求。

3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 以空白血漿配制由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個(gè)不同質(zhì)量濃度的EXH-1626 QC樣品，每一濃度各5份樣本，按“2.3”項(xiàng)下操作，計(jì)算并記錄EXH-1626與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(a)，由相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，該濃度與加入的濃度之比為相對(duì)回收率。同時(shí)以流動(dòng)相代替空白血漿，同法計(jì)算提取回收率。結(jié)果顯示，由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個(gè)濃度的相對(duì)回收率和絕對(duì)回收率分別為108.1%、106.5%、103.6%、99.7%和72.5%、76.3%、78.4%、76.6%，符合生物樣品分析要求。

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取離心管數(shù)支，制備由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個(gè)不同濃度的血漿樣本各5份，1份制備好后按“2.3”項(xiàng)下操作，立即進(jìn)樣分析；1份室溫下放置6 h；1份血樣冰箱中(4 ℃)放置12 h后同法操作；1份于冰箱中(-20 ℃)冷凍保存15 d后取出化凍；1份在1個(gè)月內(nèi)反復(fù)凍融3次，然后同法操作。結(jié)果各濃度樣本測(cè)定值的偏差均小于10%，結(jié)果表明，樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

3.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果 大鼠以80 mg/kg劑量口服EXH-1626后0.5 h，在血中均可測(cè)到其濃度，藥時(shí)曲線有雙峰現(xiàn)象，給藥后3和6 h達(dá)到濃度峰值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)BAPP軟件分別以單室和雙室模型處理，計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，比較AIC、r2、Re三個(gè)值，以r2值最大確定其為單室模型(權(quán)重系數(shù)為1)。而以250 mg/kg劑量口服給藥后于2、8、48和120 h重復(fù)達(dá)到濃度峰值，見圖3，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)BAPP軟件不能很好擬合處理，兩組主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

圖3 大鼠口服給藥藥時(shí)曲線

表1 大鼠口服給藥后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(權(quán)重系數(shù)為

大鼠尾靜脈注射后，分布很快，見圖4。其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別以單室和雙室模型處理，比較AIC、r2、Re三個(gè)值，以r2值最大確定其為單室模型(權(quán)重系數(shù)為1)。

圖4 大鼠靜脈注射給藥后的藥時(shí)曲線

大鼠口服給藥的絕對(duì)生物利用度采用公式計(jì)算：

其中AUCi.v.和AUCt分別為尾靜脈注射和口服條件下的AUC、Xiv和Xt分別為尾靜脈注射和口服的藥物劑量。由上述數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算可得，口服給予80和250 mg/kg劑量下絕對(duì)生物利用度分別為14.14%和21.74%。

表2 大鼠靜脈給藥后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(權(quán)重系數(shù)為

4 討論

4.1 流動(dòng)相及內(nèi)標(biāo)的選擇 在流動(dòng)相選擇方面，筆者研究比較了甲醇、乙腈、醋酸和三乙胺水溶液的不同濃度、有機(jī)相與水相的不同構(gòu)成比及流動(dòng)相的不同pH值對(duì)分析結(jié)果的影響，最后選擇乙腈-0.01 mol/L醋酸銨水溶液(用乙酸調(diào)pH至3)(70∶30)為流動(dòng)相，在此條件下，EXH-1626和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.9和3.5 min，目標(biāo)化合物峰形良好。

內(nèi)標(biāo)的選擇既要考慮質(zhì)譜的響應(yīng)與待測(cè)物的匹配性，又要兼顧其不與EXH-1626藥物及蛋白沉淀劑發(fā)生反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中曾篩選了多個(gè)化合物，如甲硝唑、地西泮等，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)條件下，由于保留時(shí)間較長(zhǎng)或者干擾目標(biāo)峰而放棄，選用卡馬西平為內(nèi)標(biāo)，它不僅穩(wěn)定性好，對(duì)待測(cè)物和沉淀劑穩(wěn)定，與色譜柱親和力適中，保留時(shí)間合適。

4.2 血漿樣品的前處理 本文采用蛋白沉淀法進(jìn)行血樣處理，所應(yīng)用的蛋白沉淀劑由甲醇和5%硫酸鋅溶液(體積比為70∶30)組成，用此蛋白沉淀劑直接沉淀血漿中的蛋白，不僅蛋白沉淀較完全，而且與主藥及內(nèi)標(biāo)不發(fā)生反應(yīng)，稀釋體積也小(1∶1，V/V)。沉淀離心蛋白后直接取上清液進(jìn)樣分析，此法操作簡(jiǎn)便、快速，為EXH-1626濃度的測(cè)定提供了簡(jiǎn)便、可靠的方法。

4.3 EXH-1626在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征 大鼠口服給予250 mg/kg EXH-1626后，藥時(shí)曲線呈現(xiàn)多峰現(xiàn)象，并且消除緩慢，明顯不遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，t1/2也隨給藥劑量增加而延長(zhǎng)，血藥濃度和AUC與給藥劑量明顯不成正比，呈現(xiàn)非線性動(dòng)力學(xué)過程，其在大鼠體內(nèi)處置過程存在飽和效應(yīng)。尾靜脈注射10和20 mg/kg 2個(gè)劑量后，用AUC0-∞分別除以相應(yīng)的劑量，所得比值分別為526.10和764.48，所得比值明顯不同，t1/2隨著劑量的增加而延長(zhǎng)，CL也明顯地隨劑量大小而改變。因此，EXH-1626在大鼠體內(nèi)具有非線性藥代動(dòng)力學(xué)特征。在80 mg/kg口服試驗(yàn)組中，每個(gè)動(dòng)物藥時(shí)曲線均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，尤其給予250 mg/kg劑量后，在時(shí)間靠后的取血點(diǎn)血藥濃度出現(xiàn)反復(fù)升高，這給藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算帶來很大困難。近年來已發(fā)現(xiàn)相當(dāng)多的藥物單次給藥后，血藥濃度時(shí)間曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象[3-6]，引起雙峰或多峰現(xiàn)象的常見原因可能有：肝腸循環(huán)[3,7]、多部位吸收[4]、胃腸循環(huán)[8]和蛋白競(jìng)爭(zhēng)等等，其中肝腸循環(huán)是該研究中產(chǎn)生多峰現(xiàn)象最可能的原因，這還有待進(jìn)一步研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS法測(cè)定大鼠血漿中EXH-1626的濃度，該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于EXH-1626血藥濃度的測(cè)定及其非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究，為其新藥研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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