在體大鼠心肌缺血再灌注損傷中NF－κBp65與AngⅡ的關(guān)系

楊 銳，王芬珍

（1.浙江省寧波市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科 315000；2.福建省福州市心血管病研究所 350009）

隨著20世紀(jì)80年代心臟介入治療學(xué)的推廣，心肌缺血再灌注損傷（IRI）成為一大研究熱點(diǎn)。其中NF－κB及AngⅡ均參與了心肌IRI的發(fā)生發(fā)展，在此病理過(guò)程中兩者的關(guān)系也備受關(guān)注。已有研究表明，NF－κB是AngⅡ的前體血管緊張素原再合成的重要調(diào)節(jié)因子［1］，NF－κB激活可增加組織AngⅠ及AngⅡ水平，并在轉(zhuǎn)錄水平影響AT1RmRNA表達(dá)［2］；同時(shí)AngⅡ也能激活NF－κB，且有研究認(rèn)為AngⅡ誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)是通過(guò)NF－κB／IκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。在此，我們將進(jìn)一步探討心肌IRI中NF－κB與AngⅡ的關(guān)系。

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們觀察到缺血30min再灌注60 min（I30minR60min）為 NF－κBp65蛋白表達(dá)的高峰點(diǎn)，利用抗氧化劑四氧吡咯二硫氨基（PDTC）及咪達(dá)普利分別作為NF－κB和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的特異性抑制劑，探討NF－κBp65與AngⅡ在心肌IRI中的關(guān)系及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性健康清潔型SD大鼠32只，體質(zhì)量250～300g，由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)SCXK（閩）2004－0002，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法稍加改進(jìn)建立動(dòng)物模型［3］。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：（1）IR組：缺血30min再灌注60min；（2）PDTC＋I(xiàn)R組：PDTC 125mg／kg，用0.85%的生理鹽水稀釋，于缺血前15min腹腔注射；（3）咪達(dá)普利＋I(xiàn)R組：咪達(dá)普利3mg／kg，用0.85%的生理鹽水稀釋，于缺血前15min頸外靜脈緩慢推注；（4）PDTC＋咪達(dá)普利＋I(xiàn)R組：PDTC 125mg／kg及咪達(dá)普利3mg／kg分別于缺血前15min腹腔注射及頸外靜脈緩慢推注。

1.2 標(biāo)本的采集與處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。（1）取血：含蛋白酶抑制劑的真空試管備用，迅速下腔靜脈取血2mL加入試管，用于血漿AngⅡ水平的檢測(cè)；（2）取組織：迅速剪取平行房室溝下2mm處的左室游離壁心肌，分成2塊，一塊在液氮中速凍后保存到－80℃冰箱用于核蛋白提??；另一塊新鮮組織盡快勻漿用于組織AngⅡ水平的檢測(cè)。

1.3 免疫組織化學(xué)分析法 定位和定量檢測(cè)NF－κBp65活性：光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞，如出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，活化的 NF－κBp65定位于細(xì)胞核；在高倍顯微鏡下（×200），每組切片選取10個(gè)視野，細(xì)胞總數(shù)不少于500個(gè)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)，用陽(yáng)性表達(dá)率表示NF－κBp65活化蛋白的核易位表達(dá)量。

1.4 ELISA法檢測(cè)心肌組織NF－κBp65蛋白轉(zhuǎn)錄活性 提取心肌組織細(xì)胞核蛋白，按照考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，定量細(xì)胞核蛋白數(shù)量，按TransAM NF－κBp65蛋白活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ELISA。

1.5 放射免疫分析法測(cè)定血漿和心肌組織AngⅡ含量 按試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用均相競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法直接測(cè)定血漿和心肌中的AngⅡ含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，各組間比較采用兩因素兩水平的析因分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組NF－κBp65蛋白核易位變化及NF－κBp65蛋白轉(zhuǎn)錄活性比較 由圖1、表1可見(jiàn)：PDTC＋I(xiàn)R組、咪達(dá)普利＋I(xiàn)R組及PDTC＋咪達(dá)普利＋I(xiàn)R與IR組相比，均顯著抑制NF－κBp65蛋白核易位變化，兩藥聯(lián)合效果更明顯，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；進(jìn)一步檢測(cè) NF－κBp65DNA轉(zhuǎn)錄活性，同樣，各藥物預(yù)處理組與IR組相比也可顯著抑制NF－κBp65蛋白的DNA轉(zhuǎn)錄活性，兩藥聯(lián)合效果更明顯，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 免疫組織化學(xué)分析法測(cè)定各組NF－κBp65蛋白核易位變化（×400）

表1 藥物預(yù)處理對(duì)NF－κBp65蛋白核易位的影響（，n＝8，%）

表1 藥物預(yù)處理對(duì)NF－κBp65蛋白核易位的影響（，n＝8，%）

＊：P＜0.05，與IR組比較。

核陽(yáng)性表達(dá)率IR組組別53.82±6.22 PDTC＋I(xiàn)R組 30.37±3.44＊咪達(dá)普利＋I(xiàn)R組 43.20±4.58＊PDTC＋咪達(dá)普利＋I(xiàn)R組 12.26±1.03＊

2.2 各組血漿及心肌組織AngⅡ水平的變化 由表2可見(jiàn)，各藥物處理組與IR組相比，血漿及組織AngⅡ水平顯著下降，兩藥聯(lián)合效果更明顯，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 藥物預(yù)處理對(duì)血漿及組織AngⅡ水平的影響（，n＝8）

表2 藥物預(yù)處理對(duì)血漿及組織AngⅡ水平的影響（，n＝8）

＊：P＜0.05，與IR組比較。

組別 血漿AngⅡ（pg／mL）組織AngⅡ（pg／100mg）IR組471.00±48.6194.24±13.08 PDTC＋I(xiàn)R組 378.33±31.83＊ 63.17±6.11＊咪達(dá)普利＋I(xiàn)R組 306.00±42.14＊ 55.73±7.31＊PDTC＋咪達(dá)普利＋I(xiàn)R組 284.83±26.72＊ 44.90±7.04＊

3 討 論

PDTC是NF－κB的特異性抑制劑，主要作用是：（1）具有抗氧化性，體外研究證實(shí)它可直接清除反應(yīng)性氧中介物或與其相關(guān)酶的金屬離子發(fā)生螯合作用，抑制酶活性［4］，從而抑制NF－κB激活；（2）通過(guò)阻止IκB與 NF－κB分離、阻礙 NF－κB核易位等途徑阻斷NF－κB激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］；（3）具有促氧化作用，通過(guò)螯合Cu2＋產(chǎn)生的復(fù)合物能氧化NF－κB的巰基而抑制其活性［6］。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）中的咪達(dá)普利是新一代、長(zhǎng)效ACEI類藥物，其活性代謝產(chǎn)物咪達(dá)普利拉與體內(nèi)ACE結(jié)合，降低ACE活性，高選擇性作用于腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAS），從而強(qiáng)效而持久的抑制AngⅡ的生成［7］。

從實(shí)驗(yàn)中筆者不難發(fā)現(xiàn)，與IR組比較咪達(dá)普利預(yù)處理在顯著降低血漿及組織AngⅡ含量的同時(shí)也伴隨著NF－κBp65蛋白活性的下降，提示咪達(dá)普利可能通過(guò)抑制AngⅡ的表達(dá)在一定程度上抑制NF－κBp65活性。已有多項(xiàng)研究表明ACEI和／或AngⅡ受體阻滯劑可通過(guò)抑制NF－κB激活對(duì)心肌IRI的病理過(guò)程有所改善［8－9］。AngⅡ可以作為一個(gè)內(nèi)源性促炎癥因子激活 NF－κB從而增加氧化應(yīng)激等作用［10］。Dostal等［11］指出AngⅡ可作為一個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子的合成和釋放包括 NF－κB。Muller等［12］報(bào)道轉(zhuǎn)腎素、血管緊張素原雙基因大鼠心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞NF－κBp65蛋白表達(dá)增加，提示AngⅡ介導(dǎo)的心血管損害與NF－κBp65活性有關(guān)。Marta等［13］發(fā)現(xiàn)AngⅡ可提高培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞中NF－κB的結(jié)合活性，AngⅡ受體阻滯劑可阻斷這一作用并呈劑量依賴性。因此筆者推測(cè)在心肌IRI中，激活的AngⅡ甚至RAS可激活NF－κB轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，兩者共同參與此病理過(guò)程。

其次筆者發(fā)現(xiàn)，與IR組比較PDTC預(yù)處理在顯著抑制NF－κBp65蛋白DNA轉(zhuǎn)錄活性的同時(shí)也伴隨血漿及組織AngⅡ含量的降低，提示PDTC可通過(guò)抑制NF－κBp65的激活在一定程度上抑制AngⅡ。Muller等［12］曾指出，PDTC可通過(guò)抑制NF－κB激活保護(hù)AngⅡ誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)及器官損傷。Brasier等［14］發(fā)現(xiàn)，NF－κB是 AngⅡ前體－血管緊張素原再合成的重要調(diào)節(jié)因子，因此AngⅡ的致炎作用在一定程度上依賴NF－κB的調(diào)節(jié)。對(duì)AT1受體基因序列分析也發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)序列含有NF－κB的結(jié)合序列，提示NF－κB可能會(huì)誘導(dǎo)AT1受體表達(dá)［15］。因此，筆者推測(cè)在心肌IRI中，NF－κBp65轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的激活對(duì)AngⅡ甚或RAS的激活有影響，兩者共同參與此病理過(guò)程。

最后，從藥物預(yù)處理的角度上，筆者發(fā)現(xiàn)咪達(dá)普利、PDTC或兩藥聯(lián)合預(yù)處理均抑制AngⅡ與NF－κBp65活性，ACEI類藥物對(duì)心臟的保護(hù)已毋庸置疑，PDTC的使用仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，以此為新的靶點(diǎn)，可能為臨床防治心肌IRI提供更多的途徑。

綜上所述，心肌IRI是多種生物活性因子參與的復(fù)雜病理過(guò)程，涉及多種復(fù)雜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，其中AngⅡ或RAS與NF－κBp65可相互激活，并在多層次和諸多環(huán)節(jié)存在交互作用。

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