雌激素對(duì)小鼠心室肌細(xì)胞ATP敏感性鉀離子通道活性的影響

樸伶華，姜圣男，柳賢德

(1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？冢Ｄ?570228；2. 海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，?？冢Ｄ?571199；3. 海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院，?？?，海南 570109)

隨著生活水平的提高，心臟疾病的發(fā)生率也顯著增高。心臟疾病無(wú)論是發(fā)生率還是預(yù)后，絕經(jīng)前女性要比同年齡男性低。女性在絕經(jīng)后由于體內(nèi)雌激素水平的下降，其發(fā)生率較前有明顯上升趨勢(shì)。雌激素可通過(guò)心肌細(xì)胞上的雌激素受體產(chǎn)生抑制心肌重塑、心肌肥大及減輕心肌缺血再灌注損傷等，起到對(duì)心臟的保護(hù)作用[1]。

心肌細(xì)胞膜含有一種內(nèi)向整流式鉀通道，可以通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)ATP濃度水平而影響其活性的離子通道稱之為ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP通道)[2-4]。在心肌缺血發(fā)生后，心肌細(xì)胞膜可通過(guò)增強(qiáng)KATP通道活性，使得心肌動(dòng)作電位時(shí)程縮短，從而可發(fā)生嚴(yán)重的折返性心律失常[5]。然而現(xiàn)今雌激素對(duì)KATP離子通道活性的影響還不是很清楚。因此本研究擬通過(guò)膜片鉗技術(shù)觀察雌激素對(duì)小鼠心肌細(xì)胞KATP通道活性的影響，進(jìn)一步分析雌激素在心肌缺血中的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 小鼠單一心室肌細(xì)胞制備

ICR 小鼠(25～40)g，雄性，腹腔注射肝素1 000 U/Kg，15 min后頸椎脫臼，快速開(kāi)胸取出心臟并置于4℃無(wú)鈣臺(tái)式液中洗掉部分血液，隨后迅速將心臟懸掛于Langendorff裝置上進(jìn)行主動(dòng)脈逆流灌流。先用無(wú)鈣臺(tái)式液灌流(5～10)min，之后換上0.5 g/L膠原酶II酶溶液灌流20 min，待組織變軟后換上KB溶液7 min，之后取下心室部分組織，置于KB溶液用吸管吹打，使細(xì)胞自然沉降，置于溶液中待用。灌流全程95% O2+ 5% CO2通氧。實(shí)驗(yàn)在室溫(20～30)℃下進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)溶液與試劑

無(wú)鈣臺(tái)式液(mmoL): NaCl 137 g；KCl 5.4 g；MgCl21.0 g；HEPES 10 g；Glucose 10 g，用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.4。KB溶液：KCl 25 g；taurin 20 g；L-glutamic acid 70 g；MgCl23 g；HEPES 10 g；glucose 10 g；KH2PO410 g, EGTA 0.5 g，用KOH調(diào)節(jié)至pH 7.40。單離子通道記錄溶液(mmol)：KCl 140 g；MgCl22 g；EGTA 5 g；HEPES 10 g, 用HCl調(diào)節(jié)至pH 7.2。全細(xì)胞記錄溶液(mmol)：KCl 140 g；MgCl22 g； CaCl21 g；EGTA 11 g；HEPES 10 g，用KOH調(diào)節(jié)至pH 7.2。膜內(nèi)向外記錄模式中，電極內(nèi)溶液及浴液成分(mmol)：KCl 140 g，MgCl22 g， EGTA 5 及HEPES 10 g，用HCl調(diào)節(jié)至pH 7.2。

全細(xì)胞記錄模式中，浴液使用加入1 mol/L Ca2+的臺(tái)式液，電極內(nèi)液體成分(mmol/L)：KCl 140 g，MgCl22 g, CaCl21 g, EGTA 11 g, 及HEPES 10 g，用KOH調(diào)節(jié)至pH 7.2。 Pinacidil 和2,4-dinitrophenol(DNP)作為KATP通道激動(dòng)劑， glibenclamide作為通道活性抑制劑，使用PDBu(phorbol 12,13-dibutyrate)作為protein kinase C(PKC)激動(dòng)劑，雌激素使用的是17α-ethynylestradiol 和 17β-estradiol。以上藥品均來(lái)自Sigma Chemical Co。

1.3 玻璃微電極制備

本實(shí)驗(yàn)使用borosilicate玻璃管(Clark Electromedical Instruments Co., PG150T-7.5)在兩步拉制儀(Flaming/Brown Micropipette Puller, Sutter Instrument Co.,P-97)下制備電極電阻為4-5 MΩ的微電極。制備的微電極在光學(xué)顯微鏡(Stereozoom microscope, Nikon, SMZ-2B)下涂抹Sylgard(Coring Co.)直至電極末梢部位，并進(jìn)行干燥處理。涂抹后的電極重新在光學(xué)顯微鏡(Microforge, Narishige,MF-83)下觀察(500倍)，并進(jìn)行拋光處理后直至微電極電阻為2-7MΩ。

1.4 膜片鉗記錄與分析

選取橫紋及潤(rùn)盤(pán)清楚的心肌細(xì)胞進(jìn)行膜內(nèi)向外及全細(xì)胞吸附膜片鉗方式記錄。用臺(tái)式液作為細(xì)胞外液進(jìn)行灌注。將分離的心肌細(xì)胞置于倒置顯微鏡上的浴槽中，用膜片電極進(jìn)行千兆封接。膜內(nèi)向外及全細(xì)胞吸附形態(tài)形成后，信號(hào)由Ag/AgCl電極引導(dǎo)，經(jīng)膜片鉗放大器為(Axopatch 200A, Axon Instruments Inc.)放大、數(shù)模轉(zhuǎn)換系統(tǒng)接收脈沖、采集數(shù)據(jù)，由pClamp7.0 (Axon Instruments Inc.)軟件程序記錄并分析信號(hào)。上述個(gè)實(shí)驗(yàn)在37℃恒溫下進(jìn)行。通道開(kāi)放率(Po)

在30 s內(nèi)，tj表示通道開(kāi)放時(shí)間. N 活躍期開(kāi)放通道數(shù)目。Td記錄時(shí)間，n通道數(shù)目。用如下公式測(cè)量藥物對(duì)通道活躍性影響

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均已均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，以SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 分離小鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

用急性酶解法分離的小鼠心肌細(xì)胞，在400倍光學(xué)顯微鏡下可觀察到有35%～45%的細(xì)胞是呈條柱狀，邊界清晰，橫紋排列清楚(圖1)。在本實(shí)驗(yàn)中采用具有這些特征的細(xì)胞進(jìn)行心肌細(xì)胞膜離子通道研究，發(fā)現(xiàn)封接成功率可達(dá)75%。

圖1 急性分離的心肌細(xì)胞形態(tài)

圖2 ATP敏感性鉀離子通道的確認(rèn)

2.2 ATP敏感性鉀離子通道電流確認(rèn)

當(dāng)把無(wú)ATP實(shí)驗(yàn)溶液灌流到單一心肌細(xì)胞外液中，利用膜片鉗制成膜內(nèi)向外模式，當(dāng)鉗制電壓-60 mV時(shí)，可出現(xiàn)激活的內(nèi)向型電流通道。此時(shí)，當(dāng)細(xì)胞外浴液中添加1 mmol/L ATP時(shí)，觀察到激活的通道活性逐漸減弱，1 min后無(wú)激活的通道。當(dāng)把浴液換成無(wú)ATP的溶液時(shí)，通道活性增強(qiáng)，這時(shí)候在溶液中添加KATP抑制劑glibenclamide 50 μmol/L，通道活性再次減弱，1 min后通道活性將消失(圖2)。電流-電壓相關(guān)關(guān)系曲線顯示為內(nèi)向定流性(inward rectification)，slope conductance為(62 ± 1.5)pS。維持-60 mV時(shí)，單位通道電流平均值為(3.7 ± 0.25)pA，單開(kāi)一個(gè)通道的dwell time和通道活性成反比。從以上通道的特性來(lái)看，本研究的單一活性通道可確認(rèn)為ATP-敏感性通道(KATP)。除了上述提到的特別情況，本研究的patch clamp實(shí)驗(yàn)維持-60 mV電位時(shí)出現(xiàn)的內(nèi)向電流為對(duì)象。

2.3 不同濃度雌激素對(duì)心肌細(xì)胞膜KATP通道影響

雌激素在人體內(nèi)正常生理濃度男性為(40～115)ng/L，女性(61～350)ng/L。本實(shí)驗(yàn)在鉗制電壓-60 mV細(xì)胞膜內(nèi)向外記錄模式下，依據(jù)Boyan等[6]的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)分別向浴液中加入低濃度(0.1 μmol/L)、中濃度(1 μmol/L)及高濃度(10 μmol/L)三種不同濃度雌激素觀對(duì)KATP通道的影響。觀察到兩種雌激素(17α-ethynylestradiol、 17β-estradiol) 均對(duì)KATP通道有抑制作用，且呈濃度依賴性，通道活性抑制率經(jīng)pClamp7.0系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理，其通道活性抑制的半數(shù)有效濃度分別為0.3 μmol/L 及 0.1 nmol/L(圖3)。

圖3 不同濃度雌激素對(duì)KATP離子通道的影響，半數(shù)有效濃度為0.3 μmol/L and 0.1 nmol/L

2.4 活化KATP通道早期雌激素對(duì)心肌KATP通道的影響

Pinacidil或2,4-dinitrophenol(DNP)均為細(xì)胞膜KATP離子通道開(kāi)放劑的代表藥物，能使膜KATP通道活化，通過(guò)加強(qiáng)K+離子外流，降低心肌興奮性。在鉗制電壓-60 mV細(xì)胞吸附記錄模式下，向浴液中加入pinacidil或2,4-dinitrophenol (DNP)活化KATP通道后，觀察3 min，通道活性未見(jiàn)明顯影響(圖4)。

圖4 雌激素對(duì)活化后KATP離子通道早期的影響

2.5 PDBu預(yù)處理后，雌激素對(duì)心肌細(xì)胞膜KATP通道的影響

Phorbol 12,13-dibutyrate(PDBu)是蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激動(dòng)劑的代表藥物之一，可使細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C發(fā)生活化。在鉗制電壓-60 mV細(xì)胞膜內(nèi)向外記錄模式下，向浴液中加入PDBu 0.001 nmol/L進(jìn)行預(yù)處理后，觀察到雌激素(10-8，10-3和1 μmol/L)對(duì)KATP離子通道活性的抑制作用發(fā)生明顯減弱(圖5，圖6)。

圖5 雌激素對(duì)PDBu預(yù)處理后KATP離子通道的影響

圖6 不同濃度雌激素對(duì)不同濃度PDBu抑制下KATP通道的影響

3 討論

KATP離子通道廣泛分布于心肌細(xì)胞、血管與非血管平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞中。心肌細(xì)胞中KATP屬于一種內(nèi)向整流型鉀通道。其開(kāi)放狀態(tài)主要受細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的影響，在一般正常生理情況下KATP通道處于關(guān)閉狀態(tài)，但在某些病理情況下該通道被激活，開(kāi)放的 KATP通道通過(guò)影響細(xì)胞的興奮性使動(dòng)作電位時(shí)程縮短，減少鈣內(nèi)流，減輕心肌缺血時(shí)的鈣超載，保存細(xì)胞內(nèi)ATP，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[7-8]。相反在心肌缺血缺氧的情況下，KATP離子通道的持續(xù)性開(kāi)放反而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外鉀離子積聚，減慢心臟的興奮性傳導(dǎo)，從而誘發(fā)嚴(yán)重的室性心律失常，嚴(yán)重者能夠引發(fā)室顫。

雌激素是一類G18類固醇激素，主要成分為雌二醇，有α和β兩種類型。目前研究多數(shù)認(rèn)為雌激素主要可以通過(guò)兩種途徑發(fā)揮作用：一是通過(guò)激活細(xì)胞核受體使轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，如抗凋亡基因BCL-2等[9]。一種是通過(guò)激活膜受體激活相關(guān)的酶和離子通道，調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后的修飾從而產(chǎn)生效應(yīng)[10]。有研究報(bào)道早期雌激素可增加大鼠KATP通道的蛋白表達(dá)減輕缺血再灌注損傷[11-12]，還可以通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性，提高抗氧自由基能力、抑制炎癥因子、減小心肌梗死面積、減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕大鼠在體心臟缺血再灌注損傷[13]。本試驗(yàn)采用膜片鉗技術(shù)觀察雌激素對(duì)KATP離子通道的影響，發(fā)現(xiàn)雌激素在膜內(nèi)向外膜片鉗模式中可抑制KATP離子通道活性呈濃度依賴性。結(jié)果表明，雌激素也可通過(guò)降低KATP通道的活性，使細(xì)胞外鉀離子積聚減弱，延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，減弱心肌細(xì)胞不應(yīng)期離散度，降低誘發(fā)室性心律失常的機(jī)率，從而發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺血后，機(jī)體首先可以通過(guò)各種體液調(diào)節(jié)及自身調(diào)節(jié)方式來(lái)改善心肌細(xì)胞的缺血產(chǎn)生的損傷。現(xiàn)今研究認(rèn)為KATP通道及蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)也都通過(guò)改善缺血引起的心肌損傷，從而起到保護(hù)心肌的作用[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)給與心肌細(xì)胞PKC激活劑(PDBu)預(yù)處理后，雌激素對(duì)心肌KATP通道活性的抑制作用明顯發(fā)生減弱。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有第二信使存在時(shí)(如Ca2+，cAMP等)，PKC可以作為一種與膜結(jié)合的酶，活化Na+-K+交換系統(tǒng)，提高細(xì)胞內(nèi)K+濃度。因此可推測(cè)當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生缺血后，可能由于細(xì)胞內(nèi)PKC活化增強(qiáng)，使得雌激素對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用發(fā)生了明顯的減弱，從而增強(qiáng)了誘發(fā)室性心律失常的機(jī)率。

綜上所述，本研究通過(guò)運(yùn)用膜片鉗技術(shù)觀察雌激素對(duì)心肌細(xì)胞KATP離子通道的影響，及與PKC的關(guān)系作了初步探討，揭示了雌激素可通過(guò)影響心肌細(xì)胞KATP通道活性防止心律失常的產(chǎn)生，但雌激素與PKC蛋白調(diào)控抑制的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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