樹鼩呼腸孤病毒RT-nPCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

李曉飛，殷安國，張 媛，羅 軍，孫曉梅，代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118)

哺乳動物呼腸孤病毒(mammalian orthoreovirus，MRV)在分類學(xué)上屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)第一亞群[1]?；蚪M為10個節(jié)段的雙鏈RNA，分為3個大片段(L1～L3)、3個中片段(M1～M3)及4個小片段(S1～S4)。根據(jù)紅細(xì)胞凝集活性MRV分為三種血清型及標(biāo)準(zhǔn)株，分別為：血清1型(T1L, Long)、血清2型(T2J, Jone)和血清3型(T3D, Dearing; T3A, Abney)[2]。MRV具有廣泛的宿主譜，牛、羊、馬、豬、狗、貓、小鼠、蝙蝠、人及非人靈長類體內(nèi)都已報道分離到呼腸孤病毒[3-5]。呼腸孤病毒與肺部感染、神經(jīng)系統(tǒng)感染、消化系統(tǒng)感染密切相關(guān)[6]。Reo-3感染可致小鼠呼吸窘迫綜合癥，肺水腫、肺泡出血、肺纖維化和致死性間質(zhì)性肺炎等癥狀，最后顯現(xiàn)病毒血癥及神經(jīng)系統(tǒng)感染所致腦炎心肌炎等[7]，Reo-3型是國標(biāo)要求SPF級實驗小鼠必檢的項目之一。

近年來，樹鼩(tree shrews)由于其獨特的生物學(xué)特性和分類學(xué)地位正在被培育成為實驗動物新品種，研究證實它在感染性疾病動物模型方面獨具價值。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心目前正在開展實驗樹鼩飼養(yǎng)繁殖和標(biāo)準(zhǔn)化研究工作。

2011～2012年期間，本中心先后從同一地區(qū)野外引進(jìn)了三批樹鼩，少數(shù)樹鼩出現(xiàn)精神萎靡、眼角膜及鼻分泌物增多，足爪皮膚潰爛脫皮等類似病毒性感染的臨床癥狀。為探明何種感染病原體，我們對死亡動物糞便中的未知病毒進(jìn)行分離鑒定，確認(rèn)得到三株呼腸孤病毒毒株，分別命名為TRV1、TRV2、TRV3。鑒于樹鼩對呼腸孤病毒易感，且在抵抗力差的情況下可出現(xiàn)致死性后果，需建立相應(yīng)的靈敏快速的檢測方法，作為實驗樹鼩種群病原微生物質(zhì)量控制的有效手段。

1 材料和方法

1.1 病毒及樣品

呼腸孤病毒III型(Reo3)由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所贈予；輪狀(RV)病毒W(wǎng)a株，甲肝(HAV)病毒，單純皰疹(HSV-1)病毒由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所保存；三株樹鼩呼腸孤病毒TRV1、TRV2、TRV3來源于三只動物(表1)；25只樹鼩病毒感染疑似病例的糞便處理樣本。

1.2 設(shè)備及試劑

美國產(chǎn)Forma恒溫培養(yǎng)箱，日本產(chǎn)Nikon顯微鏡，Hitachi透射電鏡,美國產(chǎn)Bio-Rad梯度PCR儀、Bio-Rad電泳儀系統(tǒng)、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)。 病毒DNA/RNA提取試劑盒購自Axygen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas；PCR試劑盒購自Thermo公司；膠回收試劑盒購自TakaRa公司。

1.3 病毒分離及電鏡觀察

采集發(fā)病樹鼩糞便(1～2)g，用磷酸鹽緩沖液(PBS) 制成10%～20%糞便懸液，5 000 r/min離心30 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液加入終濃度10%的雙抗(青霉素和鏈霉素)，按1/10(V/V)接種比接種于鋪滿80%～90%的VERO單層細(xì)胞，37℃吸附30 min，棄接種液，立即加入2%胎牛血清MEM維持液，37℃，5% CO2培養(yǎng)并觀察CPE，繼續(xù)盲傳并收集病毒液，反復(fù)凍融三次置-80℃保存待鑒定。

表1 從不同批次野外引入樹鼩中分離到的MRV

收集的病毒液于4 500 r/min離心30 min，取上清液，經(jīng)40%、20%、10%蔗糖密度梯度離心(35 000 r/min，2.5 h，4℃)，以100 μL PBS 4℃過夜溶解，次日取20 μL經(jīng)1%磷鎢酸常規(guī)染色，于Hitachi透射電鏡下觀察病毒形態(tài)。

1.4 病毒RNA提取

對正常VERO細(xì)胞，TRV1、TRV2、TRV3感染的VERO細(xì)胞上清液，呼腸孤病毒III型(Reo3)，輪狀(RV)病毒W(wǎng)a株，甲肝(HAV)病毒，單純皰疹(HSV-1)病毒以及25只樹鼩病毒感染疑似病例的糞便處理樣本按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒操作步驟提取核酸。提取后的RNA立即反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，剩余的RNA凍存于-80℃冰箱備用。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定

將TRV1、TRV2、TRV3三株病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取的病毒RNA按9∶1與10× loading buffer 混勻后經(jīng)核酸聚丙烯凝膠電泳(積層膠3.5%，分離膠10%)，每孔上樣15 μL，90 V恒壓電泳9 h，硝酸銀染色觀察[8]。

1.6 反轉(zhuǎn)錄巢式PCR

1.6.1 引物設(shè)計:哺乳動物呼腸孤病毒(MRV)的L1基因片段編碼呼腸孤病毒內(nèi)衣殼蛋白λ3，λ3具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，在呼腸孤病毒的整個基因組中是最保守的[9]。分析已報道的MRV的L1基因的保守區(qū)域，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計巢式引物見表2，依次使用兩對引物進(jìn)行巢式PCR擴增后的目的片段為513 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:參照Fermentas RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit使用說明書確定反轉(zhuǎn)錄體系為：病毒RNA 8 μL、 Random Hexamer Primer 1 μL、nuclease-free water 3 μL、5× reaction buffer 4 μL、RiboLock RNase inhibitor (20 U/μL) 1 μL、10 mM dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MuLV RT (200 U/μL) 1 μL。反應(yīng)條件為：25℃ 5 min，42℃孵育60 min，70℃ 5 min獲得cDNA。

1.6.3 巢式PCR:對巢式PCR反應(yīng)體系的引物、模板及反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)模式。第一次PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄cDNA 模板3 μL、DreamTaq Green PCR Master Mix 12.5 μL、nuclease-free water 7.5 μL，以外圍引物TRV-F1 (5 μM)、TRV-R1 (5 μM)各1 μL進(jìn)行巢式第一次PCR擴增。擴增條件：95℃變性5 min；95℃ 30 sec,50℃ 30 sec，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取第一次PCR產(chǎn)物3 μL，以內(nèi)圍引物TRV-F2 (5 μM)、TRV-R2 (5 μM)各1 μL 進(jìn)行第二次PCR擴增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同第一次PCR擴增。利用此RT-nPCR方法對正常VERO細(xì)胞、TRV1、TRV2、TRV3感染的細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測。

1.6.4 RT-nPCR產(chǎn)物的檢測:取10 μL擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)進(jìn)行電泳檢測，在1× TAE電泳緩沖液中，90 V電泳40 min，于凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并切下PCR產(chǎn)物條帶，使用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，由寶生物(大連)工程公司測序，測序結(jié)果于NCBI BLAST 進(jìn)行序列相似性和同源性分析，以確定RT-nPCR檢測的準(zhǔn)確性。

1.6.5 特異性的試驗:使用巢式引物TRV-F1,R1；TRV-F2,R2分別以三株樹鼩呼腸孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)，呼腸孤病毒III型(Reo3)，輪狀(RV)病毒W(wǎng)a株，甲肝(HAV)病毒RNA的cDNA及單純皰疹(HSV-1)病毒的DNA為模板，用所建立的RT-nPCR方法進(jìn)行擴增，擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.6 敏感性的試驗:將起始濃度為10.2 ng/μL的RNA樣本做倍比稀釋，分設(shè)100、10-1到10-10濃度梯度進(jìn)行RT-nPCR擴增，擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷可擴增的最小RNA模板濃度。

表2 用于擴增L1基因的巢式引物序列及位置

1.6.7 初步應(yīng)用:對25只樹鼩病毒感染疑似病例的糞便處理樣本(編號：1 ～25號，其中1～15號為存活動物組，16～25號樣本為死亡動物組)提取RNA，進(jìn)行RT-nPCR擴增，擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 病毒的細(xì)胞病變、電鏡形態(tài)及聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

接種病毒后的VERO細(xì)胞于12 h即出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(cytopathic effects，CPE)，繼續(xù)盲傳第2～6代均出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE，細(xì)胞顆粒感增強、圓縮、聚集最終脫落；病毒液濃縮純化后透視電鏡下觀察，可見病毒為球形顆粒，完整直徑約70 nm，雙層衣殼，為呼腸孤病毒的典型形態(tài)特征見圖1；提取三株TRV RNA進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示三株病毒均由10個基因片段組成，按分子量大小可分為大(L1、L2、L3)、中(M1、M2、M3)和小(S1、S2、S3，S4)三個類群，呈現(xiàn)典型的3:3:4排列。各分離株的PAGE電泳圖譜特征見圖2。

圖1 樹鼩呼腸孤病毒株TRV2透視電鏡觀察

圖2 三株呼腸孤病毒PAGE電泳圖譜

2.2 RT-nPCR產(chǎn)物的檢測

巢式引物TRV-F1，R1；TRV-F2，R2對三株樹鼩呼腸孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)擴增均得到長度為513 bp的特異性目的條帶；VERO細(xì)胞陰性對照未擴增到特異性目的條帶(圖3)。目的片段純化后測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，TRV1與GenBank中MRV分離株T3/Bat/Germany/342/08株和SI-MRV01株的序列同源性最高，為96%；TRV2與MRV分離株Ndelle virus株的序列同源性為90%；TRV3與MRV分離株MRV-HLJ/2007株的序列同源性為94%。

M: 2 000 bp DNA marker；1:VERO細(xì)胞對照；2：TRV1；3：TRV2； 4： TRV3

2.3 特異性試驗

巢式引物TRV-F1,R1；TRV-F2,R2在以TRV1、TRV2、TRV3及呼腸孤病毒III型(Reo3)為模板進(jìn)行擴增有明顯目的條帶出現(xiàn)，輪狀(RV)病毒W(wǎng)a株，甲肝(HAV)病毒及單純皰疹(HSV-1)均無目的條帶(圖4)。

M:2000bp DNA marker；1：呼腸孤病毒Ⅲ型;2：輪狀(RV)病毒W(wǎng)a株；3：甲肝(HAV)病毒；4：單純皰疹(HSV-1)；5：TRV1；6：TRV2；7：TRV3

M: 2000 bp DNA marker；1：RNA原液；2:10-1稀釋；3：10-2稀釋；4:10-3稀釋；5:10-4稀釋；6:10-5稀釋；7:10-6稀釋；8:10-7稀釋；9:10-8稀釋；10:10-9稀釋。

M: 2000 bp DNA marker；1～15：存活動物組；16～25號：死亡動物組

2.4 敏感性試驗

巢式引物TRV-F1,R1；TRV-F2,R2在起始濃度為10.2 ng/μL的 TRV2 RNA模板稀釋至10-4時仍可見清晰的目的條帶(圖5)，即所能檢測到的最小RNA模板濃度至少能達(dá)到0.01 pg/μL。

2.5 初步應(yīng)用

應(yīng)用建立的RT-nPCR方法對25只樹鼩病毒感染疑似病例的糞便處理樣本的檢測結(jié)果如下：存活動物組(1～15號)中2、7、10、12號糞便樣本及死亡動物組(15～25號)的15～25號糞便樣本均擴增出513 bp的目的片段。 死亡動物(15～25號)中TRV陽性攜帶率為100%；存活動物(1～15號)中TRV陽性攜帶率為27%。(圖6)

3 討論

我中心在實驗樹鼩種群建立過程中，先后三次從昆明郊區(qū)同一地域野外引進(jìn)的部分樹鼩中發(fā)現(xiàn)了病毒感染的臨床癥狀，通過病毒分離培養(yǎng)鑒定，發(fā)現(xiàn)所分離的TRV1、TRV2和TRV3病毒株具有呼腸孤病毒獨特的CPE和典型的電鏡形態(tài)，獨特的3:3:4基因組帶型，且三株病毒的L1基因序列與哺乳動物呼腸孤病毒有較高的序列同源性。采用建立的RT-nRCR方法對25只野外來源樹鼩疑似病例樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)具有較高的感染率，說明MRV的宿主范圍確實廣泛，建議作為樹鼩微生物質(zhì)量控制必須考慮的指標(biāo)之一。

目前已建立的呼腸孤病毒檢測方法有：ELISA檢測[10]、免疫熒光檢測[11]、電鏡法(DEM)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、PCR[12，13]等。電鏡法需擴增病毒、純化濃縮、超速離心，耗時耗力；PAGE法需謹(jǐn)慎防止RNA酶的降解影響，靈敏度有限，易出現(xiàn)假陰性；PCR方法具簡單、快捷、靈敏的優(yōu)點，我們曾嘗試使用Leary TR[14]報道的引物rv5m和rv4m對所分離的3株TRVs進(jìn)行擴增，但未獲得理想結(jié)果。因此改用針對L1基因保守區(qū)域設(shè)計巢式引物，并建立RT-nPCR的方法。該方法對Reo3和3株TRVs通用，且不針對同為呼腸孤病毒科的輪狀病毒、單鏈RNA的甲肝病毒和雙鏈DNA的單純皰疹病毒進(jìn)行擴增，特異性好；最低RNA模板檢測濃度為0.01pg/μL，不僅可檢測到經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)增殖后的病毒，亦可直接檢測到動物糞便中的病毒RNA。當(dāng)前我們正在研究TRV對樹鼩的致病性及致病機理，以進(jìn)一步揭示TRV的感染機制，此RT-nPCR方法可作為TRV檢測的有效手段。此外，我們提議利用此方法對野外引進(jìn)的樹鼩在隔離檢疫期間進(jìn)行TRV的篩查，這對樹鼩TRV進(jìn)行微生物控制有重要意義。

分析三株呼腸孤病毒TRV1、TRV2、TRV3基因組的聚丙烯酰胺凝膠電泳的帶型，不難發(fā)現(xiàn)三株病毒的基因組10個片段分布特征有區(qū)別，M片段和S片段差異較大。另外，經(jīng)RT-nPCR得到的L1基因的513 bp片段序列也有差異。推導(dǎo)不同時間來源的三株病毒具有一定遺傳差異，這對今后開展樹鼩呼腸孤病毒的分子流行病學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。至于TRV1、TRV2、TRV3之間的變異關(guān)系或與已報道的哺乳動物呼腸孤病毒(MRV)的親緣性關(guān)系，有賴于今后全基因序列的測定結(jié)果作進(jìn)一步的研究。

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