己烯雌酚誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對青春期大鼠睪丸類固醇合成的影響

李軍延，喬佩環(huán)，張林媛，劉 帥，于 淼，常 兵

(中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050)

己烯雌酚 (diethylstilbestrol，DES)是1938年合成的非甾體類雌激素,據(jù)報(bào)道其藥效約為17β-雌二醇的10倍[1]，曾作為預(yù)防流產(chǎn)或早產(chǎn)的藥物而被臨床廣泛使用[2],也作為動物促生長劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中[3]，雖然在全球多個(gè)國家和地區(qū)已被禁止，但是養(yǎng)殖業(yè)等非法使用依然存在[4，5]，其危害依然不可忽視。

DES具有生殖毒性在人類以及實(shí)驗(yàn)動物中已經(jīng)廣泛證實(shí)[6，7]，外源性雌激素可直接通過影響睪丸基因表達(dá)或間接通過下丘腦-垂體-睪丸軸反饋?zhàn)饔?，抑制睪酮合成，打破雌/雄激素平衡，干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響支持細(xì)胞增殖、分化及與生殖細(xì)胞的相互作用，最終導(dǎo)致雄性生殖器官發(fā)育雄性化缺失，支持細(xì)胞數(shù)量減少、功能受損，以及精子發(fā)生異常[8，9]。DES對雄性生殖系統(tǒng)危害包括氧化應(yīng)激損傷[10，11]和類固醇合成異常導(dǎo)致的睪丸睪酮減少[12-14]，但是兩者間的關(guān)系尚不清楚，我們研究DES對睪丸氧化應(yīng)激損傷與抑制類固醇合成的關(guān)系，并探討DES對雄性生殖系統(tǒng)損傷的可能的新機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)條件

健康SPF級Wistar大鼠，21日齡，雄性24只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2007-0001。動物飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心動物室，使用許可證號SYXK(京)2009-0032。全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料和經(jīng)反滲透過濾的純凈水由動物自由攝取。

1.2 材料與試劑

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)Sigma公司生產(chǎn)，黃體生成素(LH)和睪酮(T)檢測試劑由北京北方生物技術(shù)研究所提供；SOD、CAT、GPx、MDA、ROS、3β-HSD1和17β-HSD3試劑購自南京建成生物工程研究所。Trizol試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；Real-time PCR試劑盒購自KAPA Biosystem公司；723型分光光度計(jì)(天津普瑞斯公司)；熒光定量PCR儀Roche LightCycler480(美國羅氏)。

1.3 動物分組及染毒方法

動物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，確認(rèn)正常后，大鼠按體重隨機(jī)分為高10.0 μg/kg(6只)、中1.0 μg/kg(6只)、低0.1 μg/kg ( 6只)組和對照(6只)共4組。DES用無水乙醇溶解后震蕩混懸于玉米油中，根據(jù)大鼠體重確定實(shí)際染毒量，對照組僅為玉米油，每日1次連續(xù)8周皮下注射染毒。

1.4 體重與臟器重量(系數(shù))檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱取動物體重，然后麻醉處死動物，全身及內(nèi)臟觀察，取睪丸、附睪、前列腺稱重，計(jì)算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=臟器濕重/動物體質(zhì)量 × 100%。

1.5 血清及睪丸內(nèi)激素水平測定

股動脈取血5 mL，經(jīng)過低溫離心得到血清；取0.5 g睪丸，加生理鹽水制成質(zhì)量濃度為10%的組織勻漿，離心后得到睪丸勻漿；激素測定使用放射免疫方法，分別測定血清黃體生成素(LH)、睪酮(T)和睪丸勻漿中睪酮(T)，按說明書操作。

1.6 睪丸組織抗氧化酶及類固醇合成酶活性測定

睪丸勻漿用于測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、丙二醛(MDA)、活性氧自由基(ROS)、3β羥類固醇脫氫酶1(3β-HSD1)和17β羥類固醇脫氫酶3(17β-HSD3)，按說明書操作。

1.7 RT-qPCR檢測睪丸組織中類固醇合成酶mRNA表達(dá)水平

試驗(yàn)方法參照丁思進(jìn)等進(jìn)行[15]，引物設(shè)計(jì)參照Genbank中固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)、3β羥類固醇脫氫酶1(3β-HSD1)、17β羥類固醇脫氫酶3(17β-HSD3)的mRNA序列，見表1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DES暴露后體重、睪丸、附睪、前列腺重量及系數(shù)

低劑量組1只動物意外死亡。低劑量組體重與對照組比較未見改變，中和高劑量組體重顯著減少(P<0.01)，中劑量組體重與對照組比較減少15.0%、高劑量組減少17.0%；中和高劑量組單側(cè)睪丸和前列腺重量顯著減少，睪丸重量最大減少40.6%，前列腺最大減少24.9%，低劑量組未見變化；單側(cè)附睪的重量與臟器系數(shù)未見變化；見表2。

2.2 DES暴露后 SOD、CAT、GPx活性和MDA，ROS的水平

高劑量組抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性顯著降低、其中SOD和GPx的活性在中劑量組也顯著降低、SOD、CAT和GPx活性降低最大分別為36.5%、28.3%、29.2%，同時(shí)SOD和GPx活性呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，其他組未見變化；高和中劑量組MDA和ROS水平顯著升高，MDA和ROS水平升高最大分別為23.5%和31.0%，其中ROS水平的變化呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，其他組未見變化；見表3。

2.3 DES暴露后類固醇合成酶及循環(huán)和睪丸內(nèi)激素水平

高劑量組3β-HSD1活性顯著降低(P<0.01)，最大下降44.1%，17β-HSD3活性同樣顯著下降(P<0.05)，最大下降27.3%；促黃體生成素(LH)隨染毒劑量的增加而降低，中高劑量組顯著降低，最大下降30.2%，并且各組間變化呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系；循環(huán)以及睪丸內(nèi)睪酮隨劑量的增加呈現(xiàn)減少，高劑量組循環(huán)睪酮顯著減少(P<0.01)，中和高劑量組睪丸睪酮顯著減少(P<0.01)；循環(huán)睪酮最大減少16.5%，睪丸睪酮最大減少48.6%，DES對睪丸內(nèi)睪酮減少的作用更明顯；低劑量組上述指標(biāo)均未見變化；見表4。

表1引物序列

表2 DES暴露后雄性生殖系統(tǒng)的參數(shù)

表3 DES暴露后 SOD、CAT、GPx活性和MDA，ROS的水平

表4 DES暴露后類固醇合成酶及循環(huán)和睪丸內(nèi)激素水平

表5 DES暴露后睪丸內(nèi)StAR, P450scc, 3β-HSD1和17β-HSD3 mRNA的表達(dá)水平

2.4 DES暴露后睪丸內(nèi)StAR, P450scc、3β-HSD1和17β-HSD3 mRNA的相對表達(dá)水平

StAR、P450scc、3β-HSD1和17β-HSD3 mRNA水平分別降低，StAR在高劑量組與對照組比較顯著減少(P<0.05)，最大減少了25.8%，P450scc在中和高劑量組中分別顯著性減少(P<0.01、P<0.05)，最大減少56.1%。3β-HSD1在中和高劑量組中分別顯著減少(P<0.01)，最大減少了46.6%。17β-HSD3在高劑量組未出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變，僅中劑量組顯著減少(P<0.05)，最大減少29.5%；見表5。

3 討論

通過對28日齡大鼠進(jìn)行8周(包括青春前期，青春期直到性成熟期)不同劑量DES皮下注射染毒，結(jié)果顯示中和高劑量組體重、睪丸重量、睪丸臟器系數(shù)、前列腺臟器系數(shù)均減少；除附睪之外，包括睪丸和前列腺的性腺受到影響，出現(xiàn)重量減輕的現(xiàn)象。促性腺激素中促黃體生成素(LH)隨染毒劑量的增加而降低，中高劑量組顯著降低，并且各組間變化呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系；循環(huán)以及睪丸內(nèi)睪酮隨劑量的增加呈現(xiàn)減少，其中高劑量組循環(huán)睪酮顯著減少，中和高劑量組睪丸睪酮顯著減少；DES可以對睪丸中性腺以及附屬性腺直接產(chǎn)生作用，同時(shí)對下丘腦-垂體-睪丸軸激素調(diào)控產(chǎn)生影響，符合既往DES對雄性生殖毒性的作用特征[12-14]。

研究顯示一些化學(xué)物質(zhì)可以擾亂睪丸內(nèi)部環(huán)境，并通過破壞睪丸細(xì)胞的氧化/抗氧化平衡機(jī)制損傷睪丸功能[16，17]。睪酮的生物合成在睪丸間質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生睪酮的類固醇合成級聯(lián)反應(yīng)本身會產(chǎn)生活性氧ROS[18]。由于過度的ROS水平可以造成睪丸功能的損傷，所以睪丸具備一個(gè)有效的抗氧化劑體系，對ROS的損傷進(jìn)行保護(hù)[19]。但是過度的環(huán)境毒物暴露已經(jīng)顯示出干擾睪丸的氧化與抗氧化作用的平衡，損傷睪丸功能的作用[16]。DES對雄性生殖系統(tǒng)具有抑制抗氧化酶活性，提高活性氧水平，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡毒性的作用。成熟倉鼠皮下注射1.0 mg/kg 連續(xù)染毒1周，發(fā)現(xiàn)睪丸SOD、GPx和T-AOC顯著降低，MDA水平明顯增加[10]。成年雄性大鼠經(jīng)口染毒2周，睪丸形態(tài)出現(xiàn)毒性改變，具有中和ROS作用的硫氧還原蛋白-1受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化還原失常，造成睪丸的毒性損傷[11]。我們的結(jié)果顯示，染毒8周后高劑量組抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性顯著降低、其中SOD和GPx的活性在中劑量組也顯著降低、同時(shí)SOD和GPx活性呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系；高和中劑量組MDA和ROS水平顯著升高，其中ROS水平的變化呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。提示DES的生殖毒性與ROS密切相關(guān)，DES通過降低抗氧化酶水平，增加ROS含量，干擾間質(zhì)細(xì)胞正常功能，導(dǎo)致睪酮生成減少。

間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮通過StAR蛋白把膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)， P450scc將膽固醇側(cè)鏈裂解轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，3β-HSD催化孕烯醇酮轉(zhuǎn)化生成孕酮，17β-HSD3使得雄烯二酮最終催化形成具有生物活性的睪酮(T)[20]。在睪丸雄激素生物合成的過程中StAR、P450scc為限速酶，3β-HSD和l7β-HSD3是參與固醇類激素生成以及激素活性和非活性之間互相轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，對于維持哺乳動物體內(nèi)激素之間的平衡、調(diào)節(jié)激素生成和代謝發(fā)揮著重要的作用。我們的結(jié)果顯示循環(huán)以及睪丸內(nèi)睪酮隨劑量的增加呈現(xiàn)減少，其中循環(huán)睪酮最大減少16.5%，睪丸睪酮最大減少48.6%。結(jié)果表明DES可以減少循環(huán)血液和睪丸內(nèi)睪酮水平，同時(shí)對睪丸內(nèi)睪酮減少的作用更明顯。DES在胎兒期、新生兒期以及成熟期嚙齒動物暴露中雖然睪酮減少作為毒性作用共同特征之一，但是對類固醇合成酶作用顯示差異，導(dǎo)致睪酮減少的機(jī)制的不同。胎兒期小鼠暴露DES在妊娠18.5 d，類固醇合成酶系列中StAR的抑制最明顯[21]；在新生兒期出生4日大鼠DES染毒14天，3β-HSD等表達(dá)未發(fā)生變化，但是StAR表達(dá)顯著減少[22]。成熟大鼠DES染毒2周，P450scc表達(dá)明顯受到抑制，StAR表達(dá)未見改變，提示在成年大鼠類固醇合成途徑中細(xì)胞色素P450scc是DES引起生殖毒性作用的首要靶基因[23]。我們的結(jié)果顯示StAR、P450scc、3β-HSD1和17β-HSD3的mRNA表達(dá)均受到抑制，但是其中P450scc和3β-HSD1最敏感，受抑制程度高，最大降低分別為56 %和47%。類固醇合成酶中3β-HSD1的酶活性同樣顯示最敏感，最大減少約48.7 %，根據(jù)我們的結(jié)果可以推斷，DES暴露在包括青春前期、青春期在內(nèi)的整個(gè)性成熟前，主要通過抑制P450scc和3β-HSD1干擾類固醇激素合成。另外，有研究顯示對4周齡大鼠暴露DES通過3β-HSD介導(dǎo)的類固醇合成抑制，導(dǎo)致睪酮減少[24]，該研究結(jié)果支持我們現(xiàn)有性成熟前期DES暴露的數(shù)據(jù)。我們認(rèn)為在生命周期中DES對類固醇合成途徑的作用不同，可以分為胎兒和新生兒期，性成熟前期以及成熟期，當(dāng)然主要原因與間質(zhì)細(xì)胞分型有關(guān)(大鼠約在56 d前后未成熟型分化形成成熟型間質(zhì)細(xì)胞)，同時(shí)染毒劑量和方式在分期中的意義尚需考量。

我們的結(jié)果顯示DES對睪丸具有干擾氧化應(yīng)激/抗氧化平衡作用，同時(shí)影響間質(zhì)細(xì)胞正常功能，導(dǎo)致睪酮生成減少。典型內(nèi)分泌干擾物質(zhì)顯示出增加睪丸活性氧的生產(chǎn)水平并擾亂類固醇合成毒性作用特征。在類固醇激素生物合成途徑中各種酶系統(tǒng)被認(rèn)為是內(nèi)分泌干擾物重要靶基因[25]。如多氯聯(lián)苯(Aroclor 1254)在大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)中，顯示抑制抗氧化酶(SOD、CAT、GPx等)的活性，增加LPO 和ROS水平，同時(shí)減少P450scc，3β-HSD和17β-HSDmRNA轉(zhuǎn)錄水平[26]。對殺蟲劑-林丹(lindane)的體內(nèi)研究顯示，5 mg/kg的林丹染毒30 d，隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)，睪丸類固醇合成酶 3β-HSD和17β-HSD活性降低[27]。林丹單次染毒后StAR蛋白，3β-HSD和17β-HSD活性均出現(xiàn)降低[28]。在15～30 d染毒，林丹可以顯著抑制睪丸雄激素的合成，顯著減少外周血液中FSH、LH、睪酮的水平和睪丸內(nèi)睪酮的水平，同時(shí)抑制3β- HSD和17β- HSD活性[29]。上述研究結(jié)果(從體外培養(yǎng)細(xì)胞到整體動物實(shí)驗(yàn))與我們的研究結(jié)果同樣可以推論內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(雌激素活性物質(zhì))可以通過對睪丸氧化應(yīng)激的直接作用，干擾睪丸氧化/抗氧化平衡，損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能，抑制類固醇合成關(guān)鍵酶系，導(dǎo)致睪酮水平降低。我們的研究首次證實(shí)DES對睪丸氧化/抗氧化平衡的作用和睪酮減少為主要特征的雄性生殖毒性兩者的聯(lián)系。

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