一種新型脊髓打擊器的創(chuàng)制與制模大鼠行為學(xué)功能評(píng)價(jià)

季松嶺，章 濤，張 潛，徐 燕，賈臨瑛，陳 龍

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 解剖學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是脊柱外科中常見(jiàn)的難治病之一，發(fā)生年齡多為(36.3±10.12)歲[1]，主要病因系車禍傷、高處墜落傷及重物壓砸傷。SCI除造成相應(yīng)支配區(qū)域肢體運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能喪失外，還可引發(fā)多種器官的功能障礙和嚴(yán)重并發(fā)癥，致死率和致殘率高，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。尋找有效的新的治療手段成為SCI治療研究的必然趨勢(shì)，而制備可靠的SCI模型是對(duì)其進(jìn)行有效治療研究的前提。1911年，Allen[2]首次報(bào)道了采用簡(jiǎn)易的垂直落體裝置，制備大鼠SCI模型，開(kāi)創(chuàng)了SCI模型制備的實(shí)驗(yàn)先河。隨著信息技術(shù)和機(jī)械加工工藝的發(fā)展，打擊器的制作技術(shù)得到了不斷的改進(jìn)，現(xiàn)已有將撞擊裝置與電腦軟件相結(jié)合，通過(guò)電腦設(shè)置撞擊物重量與撞擊高度，達(dá)到精確控制的目的，如Gruner等[3-5]研制的NYU脊髓撞擊器即是其代表，并已得到了較為廣泛的應(yīng)用。但NYU脊髓撞擊器價(jià)格昂貴，目前國(guó)內(nèi)配備有限，全球范圍內(nèi)的研究使用覆蓋率也不過(guò)50%左右，國(guó)內(nèi)外仍有約一半的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)自制SCI撞擊器制備SCI動(dòng)物模型[6-7]，并可滿足SCI研究對(duì)模型制備質(zhì)量的要求。故本課題組也嘗試自行研制脊髓打擊器，并對(duì)其制備的大鼠SCI模型動(dòng)物進(jìn)行斜板實(shí)驗(yàn)和BBB行為學(xué)功能評(píng)分分析，結(jié)合組織HE染色觀察以評(píng)價(jià)該自制脊髓打擊器的制模效果，為下一步脊髓損傷干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的制模方案。

1 材料與方法

1.1 脊髓打擊器的制作 自制撞擊型脊髓打擊器由撞擊裝置和固定支架2部分構(gòu)成，前者(撞擊裝置)由撞擊頭和套管組成，后者(固定支架)由支撐支架和移動(dòng)支架構(gòu)成。撞擊頭的制作：取5 mL醫(yī)用一次性塑料注射器筒，注射器外套1個(gè)，用石蠟封閉注射器外套乳頭端，至圓鈍狀，再將注射器乳頭及周邊區(qū)域環(huán)形剪下，將10 g不銹鋼砝碼與修剪下的注射器乳頭共同放于電子天平上，邊稱重邊用砂紙打磨砝碼底部，直至測(cè)量總重量為10 g，采用502膠將砝碼粘于注射器乳頭，砝碼頭端系7號(hào)手術(shù)線，制成撞擊頭(見(jiàn)圖1A)。套管的制作：取醫(yī)用一次性10 mL注射器外套1個(gè)，將注射器乳頭剪除，修整注射器頭端孔徑至可容納5 mL注射器乳頭自然穿過(guò)的大小為宜。將撞擊頭裝入10 mL注射器中，以打擊頭最下端平對(duì)于套管最下端為基準(zhǔn)，撞擊頭砝碼最下端為0水平，在套管上按每厘米為刻度，標(biāo)識(shí)出不同高度位置至5 cm為止(見(jiàn)圖1A)。支撐支架和固定套管的移動(dòng)支架均由木條制作而成，支撐支架置于鼠臺(tái)之上，其作用為支撐移動(dòng)支架；移動(dòng)支架下方橫木中間加工出一個(gè)可容納套管的凹槽，將套管固定于凹槽中，套管可上下移動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，確保套管下端可以準(zhǔn)確的放置于大鼠暴露的脊髓上方(見(jiàn)圖1B)。移動(dòng)支架上方橫木中點(diǎn)釘一顆小釘，使連接打擊頭的細(xì)線可以繞其拉動(dòng)，調(diào)節(jié)砝碼升至不同高度(見(jiàn)圖1B,C)。

A：撞擊裝置的組成部件；B：移動(dòng)支架結(jié)構(gòu)圖；C：自制脊髓打擊器各部件組合后的完整效果圖。圖1 自制脊髓打擊器的構(gòu)架圖

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠100只，雌雄不拘，體重200～250g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證[動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(渝)2012-0005]。本實(shí)驗(yàn)涉及的動(dòng)物及其操作遵照國(guó)家和學(xué)校有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求進(jìn)行。將大鼠隨機(jī)分為4組，即3個(gè)模型組(分別采用自制脊髓打擊器從2、3、4 cm高度自由下落對(duì)脊髓進(jìn)行撞擊，制備SCI模型)，1個(gè)假手術(shù)組(也即對(duì)照組，采用相同的手術(shù)操作，但不對(duì)脊髓進(jìn)行撞擊)，每組25只，將每組分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，(術(shù)前1 d,術(shù)后3、7、14、28 d),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只實(shí)驗(yàn)大鼠。

1.3 采用自制脊髓打擊器制備大鼠脊髓損傷模型 實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前禁食、禁飲12 h。按每100 g體重0.36 mL的10%水合氯醛劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉生效后將大鼠俯臥固定于鼠臺(tái)上。根據(jù)肋骨計(jì)數(shù)法定位T9-11段脊椎，常規(guī)備皮、消毒。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]的入路方式行椎板切除術(shù)，充分止血后可見(jiàn)暴露的白色脊髓(見(jiàn)圖2)。將自制脊髓打擊器固定于大鼠暴露的脊髓正上方，套管下端緊貼暴露的脊髓，可自套管上口觀察是否正對(duì)暴露脊髓。將撞擊頭小心懸于套管中的相應(yīng)高度處，快速釋放撞擊頭，使其自由下落，對(duì)脊髓進(jìn)行撞擊，撞擊完成后立即移去打擊裝置?？梢?jiàn)大鼠尾部及后肢痙攣性抽搐，受撞擊脊髓呈暗紅色并有水腫現(xiàn)象，模型制備完成。術(shù)區(qū)噴灑青霉素約10萬(wàn)u，逐層縫合切口，皮膚涂碘伏消毒。術(shù)后每日進(jìn)行2次人工輔助排尿[9]，并每日腹腔注射青霉素12萬(wàn)u，連續(xù)7 d，以防泌尿系及傷口感染。

圖2 大鼠脊髓損傷模型制備圖

1.4 大鼠脊髓損傷模型制備效果評(píng)價(jià)

1.4.1 斜板實(shí)驗(yàn) 采用Rivlin[10]提出的斜板檢測(cè)方法對(duì)所有實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行斜板實(shí)驗(yàn)測(cè)量，連續(xù)進(jìn)行3次，取其平均值。

1.4.2 BBB評(píng)分 術(shù)前1周，所有大鼠在BBB評(píng)分場(chǎng)地內(nèi)自由活動(dòng)，使其適應(yīng)環(huán)境。采用盲法對(duì)進(jìn)行完斜板實(shí)驗(yàn)的大鼠按Basso[4]報(bào)道的BBB評(píng)分方法對(duì)各組大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。

1.4.3 HE染色 術(shù)后7 d的各組大鼠完成上述測(cè)試后，采用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，以脊髓的損傷處為中心上、下2 cm為取材范圍，將脊髓從椎管內(nèi)取出，置于4 %多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，以損傷中心組織制備5 μm厚連續(xù)橫切片，HE染色后置光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 斜板實(shí)驗(yàn)行為學(xué)評(píng)估結(jié)果 結(jié)果如圖3所示。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)的斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2 cm打擊組術(shù)后3、7、14、28 d斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果逐漸回升(P<0.05)，至28 d時(shí)可恢復(fù)到56°左右；3 cm和4 cm打擊組術(shù)后7 d均較3 d有所回升(P<0.05)，此后至28 d均不再增長(zhǎng)(P>0.05)，且兩組術(shù)后14 d至28 d斜板實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果值均明顯低于同一時(shí)間段的2 cm打擊組(P<0.05)。

*與同組3 d比較P<0.05；#與3 cm和4 cm組比較P<0.05；**與同組14 d和28 d比較P>0.05；##與同組14 d比較P<0.05。圖3 脊髓損傷模型大鼠斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 BBB行為學(xué)評(píng)分結(jié)果 結(jié)果如圖4所示。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分結(jié)果均為滿分21分；2 cm打擊組的BBB評(píng)分結(jié)果隨著術(shù)后時(shí)間的推移而逐步上升(P<0.05)；3 cm打擊組術(shù)后7、14、28 d評(píng)分結(jié)果明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的2 cm打擊組(P<0.05)，但與4 cm打擊組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，至28 d 3 cm與4 cm打擊組的BBB評(píng)分值均為5分左右的水平，遠(yuǎn)不及2 cm打擊組的15分的結(jié)果(P均<0.05)。

2.3 大鼠脊髓損傷組織HE結(jié)果 結(jié)果(見(jiàn)圖5)。2 cm打擊組脊髓受損組織的白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維稀疏，出現(xiàn)大面積空洞；3 cm及4 cm打擊組可見(jiàn)白質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂較2 cm嚴(yán)重，空洞面積更大，其中4 cm打擊組白質(zhì)神經(jīng)纖維空洞程度在3組中最為明顯。

*與3 cm和4 cm組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較P<0.05；#與4 cm相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較P>0.05；**與同組14 d比較P<0.05；##與同組7 d比較P<0.05。圖4 脊髓損傷模型大鼠BBB評(píng)分結(jié)果

A:2 cm高度打擊組; B:3 cm高度打擊組; C:4 cm高度打擊組。圖5 不同打擊高度至大鼠脊髓損傷的組織HE染色觀察(×200)

3 討論

1911年，Allen首次報(bào)道了采用自制的簡(jiǎn)易裝置垂直撞擊脊髓建立SCI動(dòng)物模型的方法[2]。自此以后，陸續(xù)誕生了很多的SCI模型制備改進(jìn)手段，如目前較為常用的以NYU脊髓打擊器制備SCI模型的方法[10]，其打擊頭重量為10 g，選擇下落撞擊高度分別為1.25、2.5、5 cm 3個(gè)高度，并記錄術(shù)后6周內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，其中2.5 cm與5 cm下落撞擊高度造成的BBB分值改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1.25 cm高度打擊后的BBB分值恢復(fù)高于前2個(gè)打擊高度的結(jié)果，指出2.50 cm以上打擊高度可造成成年大鼠完全性SCI。本研究根據(jù)已有脊髓打擊器的工作原理，設(shè)計(jì)制造了一款簡(jiǎn)易、可靠的脊髓打擊器，并摸索出不同高度打擊后大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果與損傷程度的關(guān)系，為今后選用不同高度打擊以獲取不同SCI損傷程度的實(shí)驗(yàn)需求提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究在驗(yàn)證自制的脊髓打擊器制模能力時(shí)選用了2、3、4 cm 3個(gè)高度，打擊頭重量均為10 g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2 cm高度下落撞擊組，術(shù)后隨時(shí)間延長(zhǎng)，斜板實(shí)驗(yàn)及BBB評(píng)分結(jié)果均有顯著提升，表明2 cm高度下落撞擊造成的大鼠脊髓損傷屬于不完全性的損傷，可通過(guò)脊髓損傷后的自行修復(fù)也即可塑性使得大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能得以部分恢復(fù)[11]。而3 cm高度撞擊組及4 cm高度撞擊組，術(shù)后3 d行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，與2 cm打擊組相比也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩組術(shù)后7 d之后的斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再上升，BBB評(píng)分結(jié)果也僅有輕微提升，均顯著低于2 cm打擊組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果。3 cm和4 cm高度組BBB評(píng)分結(jié)果與董賢慧等[12]自制的大鼠脊髓打擊器致傷結(jié)果相似。上述結(jié)果表明，3 cm及以上高度下落撞擊脊髓所造成的損傷程度要明顯重于2 cm高度撞擊所造成的損傷，而2 cm撞擊高度僅能造成大鼠脊髓的不完全性損傷，這些特征也與Vijayaprakash KM等[6]自制的大鼠脊髓打擊器采用10 g重物自1.25 cm和2.5 cm兩個(gè)高度下落對(duì)脊髓進(jìn)行打擊的結(jié)果吻合。

本實(shí)驗(yàn)采用HE染色觀察到不同高度撞擊所致脊髓組織損傷程度的差異性特點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了該打擊器在制備不同程度脊髓損傷實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值?？偠灾?，采用該裝置制備的大鼠SCI模型還具有術(shù)后動(dòng)物成活率高，制模操作簡(jiǎn)便，制模效果穩(wěn)定等的特點(diǎn)，并且自制的脊髓打擊器所用材料易得，加工技術(shù)和工藝簡(jiǎn)單，只需按照本文方法中的文字和圖片介紹即可收集所需材料進(jìn)行制作加工。本研究創(chuàng)制的脊髓打擊器的成功應(yīng)用，為后續(xù)干細(xì)胞移植治療SCI的實(shí)驗(yàn)研究提供了一種理想的動(dòng)物模型制備裝置。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳銀海, 劉敏, 何井華. 脊髓損傷患者流行病學(xué)調(diào)查[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(6):1032-1034.

[2] Allen A R. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column a preliminary report[J]. JAMA, 1911,57(11):878-880.

[3] Gruner J A. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat[J].J Neurotrauma,1992,9(2):123-126.

[4] Basso D M, Beattie M S, Bresnahan J C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transaction[J]. Exp Neurol,1996,139(2):244-256.

[5] Thomas A J, Nockels R P, Pan H Q, et al. Progesterone is neuroprotective after acute experimental spinal cord trauma in rat[J]. Spine,1999,24(20):2134-2138.

[6] Vijayaprakash K M, Sridharan N. An experimental spinal cord injury rat model using customized impact device: A cost-effective approach[J]. J Pharmacol Pharmacother, 2013,4(3):211-213.

[7] 王巖峰,秦光華,楊明超,等. 高壓氧對(duì)大鼠脊髓損傷后Bcl-2表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,42(4),293-300.

[8] Hyun S J, Lee C H, Kwon J W, et al. Comparative analysis between thoracic spinal cord and sacral neuromodulation in a rat spinal cord injury model: a preliminary report of a rat spinal cord stimulation model[J].Korean J Spine, 2013,10(1):14-18.

[9] Roy F D, Yang J F, Gorassini M A. Afferent regulation of leg motor cortex excitability after incomplete spinal cord injury[J]. J Neurophysiol, 2010,103(4):2222-2233.

[10] Young W. Spinal cord contusion models[J]. Prog Brain Res,2002,137:231-255.

[11] Basso D M, Beattie M S, Bresnahan J C. Descending systems contributing to locomotor recovery after mild or moderate spinal cord injury in rats: experimental evidence and a review of literature[J]. Restor Neurol Neurosci, 2002,20(5):189-218.

[12] 董賢慧, 賀小平, 趙利兵, 等. 自制擊打器建立大鼠脊髓損傷模型[J]. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013,30(4):285-287.