MicroRNA-7基因敲減小鼠模型的鑒定

朱順飛，李永菊，陳 超，胡 燕，趙娟娟，郭萌萌，陶弋婧，秦娜琳，徐 林

(遵義醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室暨貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，貴州 遵義 563099)

微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)是新近研究報(bào)道的miRNA家族成員之一，定位于第15號(hào)染色體，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道其在細(xì)胞和組織器官發(fā)育以及多種腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[1-3]。如Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7可靶向作用于RAF1蛋白，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；Meza-Sosa等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7通過(guò)抑制腫瘤蛋白KLF4的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；Pollock等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7可通過(guò)調(diào)控P53信號(hào)途徑抑制大腦皮層的發(fā)育。由于miR-7在不同細(xì)胞以及組織器官中的靶分子不同，因此其調(diào)控機(jī)體細(xì)胞發(fā)育和組織器官功能的確切機(jī)制仍待大量研究闡明。我們課題組在前期實(shí)驗(yàn)中利用miRNA sponge(海綿體)技術(shù)原理，成功構(gòu)建了miR-7的真核表達(dá)載體pEGFP-C2-miR-7-sponge，其可以有效下調(diào)人肺癌細(xì)胞中miR-7成熟體的表達(dá)[7]，并利用此載體構(gòu)建了miR-7基因敲減小鼠模型。本研究中，我們常規(guī)剪取了miR-7基因敲減小鼠的腳趾和尾巴，分別提取其基因組DNA和總RNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因—增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)片段；利用Real-time探針法檢測(cè)兩組小鼠7個(gè)不同組織器官中miR-7成熟體的相對(duì)表達(dá)水平，以鑒定miR-7基因敲減小鼠模型；并初步觀察模型小鼠中心臟、肺臟等組織器官的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變，以期為后續(xù)深入研究miR-7分子在不同細(xì)胞以及組織器官發(fā)育中的生物學(xué)功能提供前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周SPF級(jí)FVB小鼠和第5代miR-7KD的FVB小鼠[廣州賽業(yè)生物科技有限公司，許可證號(hào)：SYXK(蘇2010-0003)]；Premix ExTaqVersion2.0、RNAisoTMPlus、2xSYBR (r) PremixExTaq TM(TaKaRa)；T RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)；miR-7的Real-time PCR探針(MBI公司)；IANamp Genomic DNA Kit(天根公司)；HE染色液(泰康醫(yī)療)；分析純級(jí)三氯甲烷、無(wú)水乙醇、異丙醇(重慶川東化工)；C1000TMThermal cycler熒光定量PCR儀、S1000TMThermal cycler PCR儀(Bio-Rad公司)；LEGEND MICRO21R型低溫離心機(jī)(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腳趾基因組DNA和尾巴總RNA的提取 常規(guī)剪取7只miR-7KD小鼠的腳趾和尾巴，分別用來(lái)提取其基因組DNA和總RNA；剪取1只WT小鼠的尾巴，提取其總RNA?；蚪MDNA的提取方法和反應(yīng)體系均按照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說(shuō)明書操作。RNA提取操作如下：每50～100 mg組織中加入RNAisoPlus 1mL，勻漿器研磨，每毫升勻漿液加入200 μL三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min，10 000 rmp低溫離心10 min，將離心后得到的上清液移入新的離心管中，隨后加入500 μL異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 rmp低溫離心10 min，可見管底R(shí)NA絮狀沉淀，棄上清，75%乙醇1mL洗滌RNA沉淀，7 300 rpm低溫離心5 min，棄上清，干燥RNA沉淀，加入60 μLRNAse free water 溶解該RNA沉淀。

1.2.2 小鼠7個(gè)不同組織器官總RNA提取 常規(guī)解剖獲取WT和miR-7KD小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺和胰腺各70mg，用來(lái)提取總RNA，提取操作方法見1.2.1；同時(shí)，兩組小鼠心臟、肺臟、結(jié)腸分別置于4%甲醛中，為HE染色切片備用。

1.2.3 總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 內(nèi)參基因GAPDH按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明書操作，RNA 7.5 μL，oligo(dT)18 primer 1 μL，DEPC treated water 3.5 μL，65 ℃5 min，立即取出冰浴2 min以上;5x reaction buffer 4 μL，RibolockRnase inhibiter 1 μL，Revert Aid Reverse Transcriptase 1 μL，10 mM dNTP mix 2 μL，42 ℃1 h, 70 ℃10 min，4 ℃保存。miR-7逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件：10 mM dNTP mix 1.5 μL，Revert Aid Reverse Transcriptase 0.25 μL，5×reaction buffer 3 μL，RibolockRnase inhibiter 0.19 μL，RNA 5 μL，5×Abion Primer 3 μL，DEPC treated water 2.06 μL，總體系為15 μL。反應(yīng)條件：16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃30 min，降至4 ℃。

1.2.4 檢測(cè)兩組小鼠7個(gè)不同組織器官中miR-7成熟體的相對(duì)表達(dá)水平 利用Real-time PCR技術(shù)對(duì)組織器官中 miR-7 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)和比較分析。內(nèi)參基因GAPDH的上游引物為：5’-GAGCCAAACGGGTCATCATCT-3’，下游引物為：5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTT-3’。

內(nèi)參基因 Real-Time PCR 反應(yīng)體系：2×SYBR(r) PremixExTaq TM 10 μL，DEPC treated water 7 μL，cDNA 2 μL，PCR Forward Primer(10 M) 0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 M) 0.5 μL，總體系為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃ 15s, 60 ℃ 60s，40個(gè)循環(huán)，獲取熒光信號(hào)溫度為84 ℃，以排除引物二聚體的干擾；miR-7的上游引物為：5’-CACTCCAGCTGG TCGTC GTGAGTAAT-3’，下游引物為：5’-TGGTGTCGTGGAGGAGTC-3’。miR-7 Real-Time PCR 反應(yīng)體系：2×SYBR(r) PremixExTaq TM 10 μL，cDNA 1 μL，DEPC treated water 8 μL，Taqman miR-7 Probe 1 μL，總體系為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃ 15 s, 60 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)，獲取熒光信號(hào)溫度為 60 ℃。隨后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在 2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和靈敏度。miR-7 的表達(dá)量以 GAPDH 為內(nèi)參，采取 2-△△Ct方法計(jì)算。

1.2.5 HE染色觀察小鼠心臟、肺臟以及結(jié)腸的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu) 將備用的組織器官做切片并進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下分別觀察心臟、肺臟以及結(jié)腸的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 miR-7KD小鼠DNA中EGFP表達(dá)的檢測(cè) 分別提取7只miR-7KD小鼠腳趾的基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行水平板微型電泳顯示其完整性好(見圖1A)。隨后以基因組DNA為模板，用pEGFP-C2-miR-7-spong真核表達(dá)載體特異性引物PCR擴(kuò)增目的片段EGFP，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到約440bp大小的目的條帶(見圖1B)，這提示7只miR-7KD小鼠均為轉(zhuǎn)基因小鼠。

A:1～7代表7只miR-7KD小鼠基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，M代表marker；B：1～7代表7只miR-7KD小鼠以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增目的片段EGFP瓊脂糖凝膠電泳圖，M代表marker。圖1 miR-7KD小鼠基因組DNA中EGFP表達(dá)的檢測(cè)

2.2 miR-7 KD小鼠鼠尾EGFP表達(dá)的檢測(cè) 分別常規(guī)剪取兩組小鼠的鼠尾，提取其總RNA(見圖2A)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同樣利用特異性引物PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段，2.5%瓊脂糖凝膠電泳后顯示，除WT小鼠外，miR-7KD的7只小鼠均可觀察到約440bp大小的目的條帶(見圖2B)，這提示pEGFP-C2-miR-7-spong真核表達(dá)載體能夠在miR-7KD小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。

A：1～7和WT分別代表7只miR-7KD小鼠和野生型小鼠的鼠尾總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；B：1～7和WT分別代表7只miR-7KD小鼠和野生型小鼠以鼠尾CDNA為模板PCR擴(kuò)增目的片段EGFP瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2 miR-7KD小鼠鼠尾EGFP表達(dá)的檢測(cè)

2.3 兩組小鼠7個(gè)不同組織器官總RNA的純度鑒定 分別提取WT小鼠和miR-7KD小鼠的心臟、肝臟和脾臟等7個(gè)不同組織器官的總RNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示提取的RNA質(zhì)量完好，無(wú)明顯的降解(見圖3A、3B)，測(cè)得OD260/280值均為1.86～2.03。

A：1-7代表WT小鼠7個(gè)不同組織器官的總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖，M代表Marker；B：1-7代表miR-7KD小鼠7個(gè)不同組織器官的總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖，M代表Marker。圖3 WT小鼠和miR-7KD小鼠7個(gè)不同組織器官總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 兩組小鼠7個(gè)不同組織器官miR-7成熟體相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 我們進(jìn)一步利用Real-time PCR探針法分別檢測(cè)了WT小鼠和miR-7KD小鼠7個(gè)不同組織器官中miR-7成熟體的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-7成熟體在miR-7KD小鼠心臟、肝臟和脾臟等組織器官中的表達(dá)水平較WT小鼠均顯著下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。

2.5 miR-7KD小鼠心臟、肺臟以及結(jié)腸形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變 WT小鼠和miR-7KD小鼠心臟、肺臟以及結(jié)腸HE染色(見圖5)。結(jié)果顯示，miR-7KD小鼠中心肌細(xì)胞發(fā)生明顯壞死，數(shù)量減少，伴間質(zhì)大片出血；肺臟間質(zhì)小血管充血伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域可見肺泡腔塌陷；結(jié)腸黏膜顯著變薄，腺體數(shù)量減少、萎縮。

*P<0.05,**P<0.01。圖4 miR-7KD小鼠較WT小鼠7個(gè)不同組織器官中miR-7成熟體相對(duì)表達(dá)水平

箭頭提示組織器官形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變。圖5 miR-7KD小鼠心臟、肺以及結(jié)腸的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變

3 討論

目前，隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，已知miRNA的數(shù)量與日俱增。不過(guò)，大部分miRNA的生物學(xué)功能仍然未知。在基因功能研究中，最有效的方法是利用基因敲出/敲減或過(guò)表達(dá)技術(shù)來(lái)改變特定基因的表達(dá)，進(jìn)而分析其生物學(xué)功能。因此，對(duì)于miRNAs分子來(lái)說(shuō)，基因敲出/敲減或過(guò)表達(dá)技術(shù)也是深入探討其生物學(xué)功能的重要手段之一。已有的研究顯示，與miRNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸可作為mRNA結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑來(lái)研究特定miRNAs分子的生物學(xué)功能，但是此技術(shù)抑制效能時(shí)間短，只能做短期分析[8-10]。miRNA海綿體技術(shù)則是目前使用最多的高效miRNA抑制劑，不僅其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，且抑制效力和持續(xù)時(shí)間均顯著優(yōu)于反義寡核苷酸。因此，利用此技術(shù)使得構(gòu)建特定miRNA分子敲出/敲減的轉(zhuǎn)基因小鼠模型變得相對(duì)容易。本研究中，我們?cè)谥皯?yīng)用miRNA海綿體技術(shù)成功構(gòu)建的miR-7真核表達(dá)載體pEGFP-C2-miR-7-sponge基礎(chǔ)之上[7]，進(jìn)一步鑒定基于該載體構(gòu)建的miR-7基因敲減小鼠模型。PCR結(jié)果顯示，第五代模型小鼠腳趾基因組DNA和鼠尾總RNA中仍能擴(kuò)增出目的片段EGFP。這提示，我們利用pEGFP-C2-miR-7-spong載體不僅成功構(gòu)建了miR-7基因敲減小鼠模型，且pEGFP-C2-miR-7-sponge真核表達(dá)載體能夠在小鼠基因組中穩(wěn)定遺傳表達(dá)。我們隨后利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了miR-7KD小鼠較WT小鼠心臟、肝臟以及脾臟等7個(gè)重要組織器官中miR-7成熟體的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-7KD小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺以及胰腺的miR-7成熟體的表達(dá)水平較WT小鼠均顯著下調(diào)，這表明miRNA sponge技術(shù)可在體內(nèi)長(zhǎng)效抑制miRNA的表達(dá)。

新近研究顯示，miR-7與肺癌、乳腺癌、肝癌以及胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如Okuda等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7可通過(guò)對(duì)KLF4信號(hào)途徑的調(diào)控作用抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移；Ma等[12]研究還發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，低表達(dá)miR-7可上調(diào)Cullin 5蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化；Nieto等[13]研究則顯示，miR-7在胰腺癌中是顯著低表達(dá)的，上調(diào)其表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移侵襲能力。類似地，我們課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-7可顯著抑制CGGBP1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)[14]。本研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-7基因敲減小鼠模型中心臟、肺臟以及結(jié)腸均較WT小鼠形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病理性改變。這些研究結(jié)果提示，miR-7作為miRNA家族的重要分子之一，不僅在組織器官腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而且在機(jī)體組織器官的發(fā)育中也具有重要的調(diào)控功能。因此，后續(xù)進(jìn)一步利用此模型深入探討miR-7調(diào)節(jié)這些組織器官發(fā)育的具體調(diào)控機(jī)制，不僅對(duì)于最終闡明miR-7的生物學(xué)功能，而且對(duì)于探討特定組織器官的發(fā)育學(xué)也具有重要意義。

總之，本研究中我們發(fā)現(xiàn)利用miRNA-sponge技術(shù)原理構(gòu)建的miR-7基因敲減小鼠模型中，7個(gè)重要組織器官miR-7成熟體的表達(dá)水平均較WT小鼠顯著下調(diào)，這為后續(xù)深入研究miR-7在組織器官發(fā)育中的作用及其相關(guān)機(jī)制提供了重要的前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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