DNA-PKcs影響肝癌耐藥細(xì)胞BEL7402/5-FU耐藥性的機(jī)制

李長(zhǎng)福，梁大敏，束 波，楊加偉，生 欣，范 芳

(遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

在細(xì)胞的生存過程中DNA會(huì)遭受各種內(nèi)外源性因素的損傷，使DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂(double-stranded breaks, DSBs)，如果這些損傷得不到及時(shí)修復(fù)，可引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這也是抗癌藥物致腫瘤細(xì)胞死亡的主要機(jī)制[1-2]。非同源重組修復(fù)(nonhomologous end-joining，NHEJ)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最重要的一種修復(fù)機(jī)制， DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是NHEJ的核心組分，在DSBs修復(fù)及癌癥預(yù)防方面發(fā)揮重要作用[3-4]。

為進(jìn)一步研究DNA-PKcs在NHEJ修復(fù)通路及腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用，本研究將靶向DNA-PKcs的干擾質(zhì)粒shDNA-PKcs轉(zhuǎn)染肝癌耐藥細(xì)胞BEL7402/5-FU，觀察DNA-PKcs基因沉默對(duì)其下游分子Artemis的激活作用，探討DNA-PKcs基因影響肝癌細(xì)胞Bel7402/5-FU 耐藥性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 PRNAi-U6.1-Neo shRNA質(zhì)粒(百奧邁科生物科技有限公司)，BEL7402/5-FU細(xì)胞株(南京凱基公司)， LipofectamineTM2000 Reagent(Invitrogen公司)，DNA-PKcs抗體(Assay biotech公司)，Artemis抗體及P-Artemis抗體(abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS、20 μg/mL 5-FU的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)BEL7402/5-FU細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，隔天傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)好的BEL7402/5-FU細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒組和shDNA-PKcs轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將BEL7402/5-FU細(xì)胞按8×104細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按200 μL/孔將質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物加至相應(yīng)培養(yǎng)孔中，6 h后換液。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DNA-PKcs mRNA水平的表達(dá) 按Trizol?Reagent試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA行real-time PCR擴(kuò)增，DNA-PKcs及β-actin引物見參考文獻(xiàn)[5]。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DNA-PKcs mRNA表達(dá)量通過公式2-( △△CT)分析計(jì)算。

1.2.4 Western blot檢測(cè)DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白表達(dá) 按常規(guī)方法提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法計(jì)算樣品蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，室溫封閉1h，加一抗4℃過夜，用TBST洗膜3次。加二抗37℃孵育1h后TBST洗膜3次，用ECL發(fā)光液顯色曝光，Quantity One定量分析軟件分析灰度比。

2 結(jié)果

2.1 DNA-PKcs mRNA水平表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(見圖1)：各對(duì)照組細(xì)胞中DNA-PKcs mRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，shDNA-PKcs轉(zhuǎn)染組DNA-PKcs mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)(P<0.01)。

**:與空白對(duì)照組相比圖1 各組細(xì)胞DNA-PKcs mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染shDNA-PKcs 48h后收集細(xì)胞，通過Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表達(dá)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(見圖2～4)：各對(duì)照組細(xì)胞中DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；shDNA-PKcs轉(zhuǎn)染組DNA-PKcs、Artemis蛋白表達(dá)均下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；shDNA-PKcs轉(zhuǎn)染組P-Artemis蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無差異 (P>0.05)。

A：空白對(duì)照組;B：脂質(zhì)體組;C：質(zhì)粒對(duì)照組;D：shDNA-PKcs轉(zhuǎn)染組。圖2 各組細(xì)胞DNA-PKcs、Artemis和P-Artemis蛋白表達(dá)情況

**:與空白對(duì)照組相比 P<0.05。圖3 各組細(xì)胞DNA-PKcs蛋白的表達(dá)

**:空白對(duì)照組相比 P<0.05。圖4 各組細(xì)胞Artemis和P-Artemis蛋白表達(dá)情況

3 討論

目前認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞DNA損傷及其修復(fù)機(jī)制缺陷有關(guān)，而腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性主要取決于細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的能力。NHEJ是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最重要的一種修復(fù)機(jī)制，DNA-PKcs是NHEJ的核心組分，在DSBs修復(fù)及癌癥預(yù)防方面發(fā)揮重要作用[3-4]。在NHEJ中，Artemis是DNA-PKcs的下游靶分子，在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期檢測(cè)及腫瘤耐藥中均起關(guān)鍵作用。

DNA -PKcs是由4128個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子量為469kD的大分子量蛋白質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DSBs時(shí)，DNA-PKcs招募NHEJ中的組分Ku70/80迅速結(jié)合到DNA斷端，通過自身磷酸化和磷酸化下游蛋白如Artemis、DNA ligase4、XRCC4等對(duì)損傷DNA進(jìn)行修復(fù)[6-7]。DNA-PKcs被認(rèn)為具有腫瘤抑制功能，能維持基因組穩(wěn)定性。目前已有一些研究表明下調(diào)DNA-PKcs能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[8-9]。在NHEJ中，Artemis是DNA-PKcs的下游靶分子，具有多個(gè)DNA-PKcs的磷酸化位點(diǎn)[10-12]。本課題組前期研究工作發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染靶向DNA-PKcs的干擾質(zhì)粒后，肝癌耐藥細(xì)胞BEL7402/5-FU對(duì)化療藥物的敏感性增加[5]，而DNA-PKcs是NHEJ修復(fù)通路中的核心組分，說明腫瘤細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)與腫瘤耐藥有關(guān)。為進(jìn)一步了解DNA損傷修復(fù)與肝癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制，觀察肝癌耐藥細(xì)胞在DNA損傷修復(fù)過程中DNA-PKcs基因?qū)ζ湎掠伟蟹肿拥募せ钋闆r，探討NHEJ修復(fù)通路肝癌耐藥中所起的作用，本實(shí)驗(yàn)用Western blot法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染shDNA-PKcs后各組細(xì)胞Artemis、P-Artemis蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示DNA-PKcs沉默后肝癌耐藥細(xì)胞BEL7402/5-FU中DNA-PKcs及Artemis蛋白表達(dá)減少，說明DNA-PKcs表達(dá)的抑制可以下調(diào)其下游靶分子Artemis的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染組P-Artemis表達(dá)與對(duì)照組相比無差異，說明DNA-PKcs的沉默不能抑制Artemis的磷酸化，因此推測(cè)Artemis不僅是DNA-PKcs的下游靶分子，還有可能是其他信號(hào)通路的靶分子。事實(shí)上，有研究表明Artemis參與NHEJ修復(fù)過程中還需要ATM的激活[13-14]。因此DNA-PKcs沉默所致Bel7402/5-Fu細(xì)胞耐藥性降低，不一定與DNA-PKcs/Artemis通路有關(guān)，可能還有其他信號(hào)通路共同參與，其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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