金釵石斛種子萌發(fā)率提高及可誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的研究

徐德林，蔡振鋒，張 林，儲(chǔ)士潤(rùn)，祝 飛，錢 剛

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 第一臨床學(xué)院，貴州 遵義 563099)

由于金釵石斛極高的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[1]，長(zhǎng)期以來被人們過度采摘，再加上其自然生長(zhǎng)緩慢、繁殖率低等生物因素影響，野生資源漸近枯竭，目前資源瀕危[2]，已被列為國(guó)家二類保護(hù)植物并列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》[3]。因此，如何保護(hù)種質(zhì)資源，并降低人們對(duì)野生金釵石斛的依賴，實(shí)現(xiàn)金釵石斛資源的可持續(xù)發(fā)展和利用迫在眉睫。近年來，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步和栽培技術(shù)的不斷發(fā)展，金釵石斛的人工繁育已成一定規(guī)模[1,4]，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗正成為科研工作者積極探索的熱點(diǎn)。針對(duì)金釵石斛種子自然發(fā)芽率極低的狀況，本研究明確了最適種子萌發(fā)的培養(yǎng)基；并利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)尋求誘導(dǎo)金釵石斛愈傷組織培養(yǎng)基，為實(shí)現(xiàn)其快速無性繁殖提供保障和技術(shù)參數(shù)，也為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、細(xì)胞雜交、多倍體優(yōu)質(zhì)種苗培育等后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 金釵石斛未開裂的蒴果。

1.2 金釵石斛蒴果消毒 取尚未開裂的金釵石斛蒴果，流水下沖洗20 min，置超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s，并不斷輕搖，用無菌水沖洗3次，然后在加入有兩滴Tween-80的0.1%升汞中浸泡12 min，浸泡過程中不斷輕搖，最后用無菌水沖洗5次，用吸水紙吸干表面的水分，備用。

1.3 金釵石斛種子的播撒 在超凈工作臺(tái)上將消毒后的金釵石斛蒴果用無菌解剖刀縱向剖開，用無菌鑷子輕輕鑷取種子播撒在預(yù)先配置好的固體培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶培養(yǎng)基播撒量以均勻鋪陳在培養(yǎng)基表面為宜。

1.4 萌發(fā)率計(jì)算方法 每種培養(yǎng)基取5皿，統(tǒng)計(jì)并記錄每皿中萌發(fā)的種子數(shù)和種子總數(shù)，取二者的比值作為萌發(fā)率。

1.5 培養(yǎng)基配制與培養(yǎng)方式 以MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加萘乙酸(Napthalene acetic acid，NAA)、6-芐基腺嘌呤(6-Benzyl adenine，6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)三種不同激素組合，使用的天然添加物為土豆，加入量為10g/L，各種培養(yǎng)基附加30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH5.95(高壓滅菌前)。采用光照和黑暗兩種培養(yǎng)方式進(jìn)行金釵石斛種子的萌發(fā)誘導(dǎo)和愈傷組織的誘導(dǎo)(見表1)。培養(yǎng)基接種外植體后在溫度為25±2℃、光照周期12h/d、光照強(qiáng)度2000—2500lx條件下進(jìn)行種子的萌發(fā)與愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究。每種培養(yǎng)基接種10瓶，30 d后統(tǒng)計(jì)金釵石斛種子萌發(fā)情況和愈傷組織誘導(dǎo)情況。

表1不同培養(yǎng)基組分

編號(hào)培養(yǎng)基組分1MS+2,4-D 0.2 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L2MS+2,4-D 0.5 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L3MS+2,4-D 1.0 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L4MS+NAA 0.2 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L5MS+NAA 0.5 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L6MS+NAA 1.0 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L7MS+NAA 0.2 mg/L +土豆10 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L8MS+NAA 0.5 mg/L +土豆10 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L9MS+NAA 1.0 mg/L +土豆10 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L10MS+NAA 0.2 mg/L +6-BA1.0 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L11MS+NAA 0.5 mg/L +6-BA1.0 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L12MS+NAA 1.0 mg/L +6-BA1.0 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L13MS +土豆10 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L14MS+2,4-D 0.2 mg/L+碳顆粒0.2 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L15MS+2,4-D 0.5 mg/L+碳顆粒0.2 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L16MS+2,4-D1.0 mg/L+碳顆粒0.2 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L17MS+NAA0.2 mg/L +碳顆粒0.2 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L18MS+NAA0.5 mg/L +碳顆粒0.2 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L19MS+NAA1.0 mg/L +碳顆粒0.2 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L20MS+碳顆粒0.2 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L

1.6 幼苗株高的測(cè)量方法 隨機(jī)抽取相同培養(yǎng)基下萌發(fā)45 d的光培養(yǎng)與暗培養(yǎng)組培苗各30株，測(cè)量株高，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 種子萌發(fā)的誘導(dǎo)

2.1.1 金釵石斛種子成熟度對(duì)萌發(fā)的影響 成熟的金釵石斛蒴果呈黃綠色，種子為金黃色針狀；而未成熟的蒴果為淺綠色，種子為淺白色針狀；成熟的種子在第9天時(shí)開始萌發(fā)(見圖1)，萌發(fā)率可達(dá)到92.5%；未成熟的種子16 d后才開始萌發(fā)，萌發(fā)率為80.5%。

圖1 萌發(fā)的金釵石斛種子

2.1.2 天然添加物土豆對(duì)種子萌發(fā)的影響 同種激素比例條件下，加入天然添加物土豆對(duì)金釵石斛種子萌發(fā)的影響如圖2所示，由圖可以看出在其它條件相同的情況下未添加土豆的培養(yǎng)基種子萌發(fā)率都要高于添加土豆的培養(yǎng)基。但在不添加任何激素的條件下只加入土豆，種子的萌發(fā)率可達(dá)92.5%。

橫坐標(biāo)為表1培養(yǎng)基編號(hào)。 圖2 激素濃度和天然添加物對(duì)金釵石斛種子萌發(fā)率的影響

2.1.3 培養(yǎng)方式對(duì)種子萌發(fā)的影響 在其它條件都相同的條件下，光照培養(yǎng)與黑暗培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式都可以使種子萌發(fā)，但光照培養(yǎng)種子萌發(fā)時(shí)得到

的是鮮綠色的原球莖，黑暗培養(yǎng)種子萌發(fā)時(shí)得到的原球莖為上端淺白色，下端淺黃色(見圖3)。通過測(cè)量我們發(fā)現(xiàn)，黑暗培養(yǎng)種子萌發(fā)后長(zhǎng)出的幼苗的平均高度為1.45 cm，顯著高于光照培養(yǎng)的1.22 cm(見表2)。進(jìn)一步將暗培養(yǎng)的小苗其轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)，3～4 d后即可轉(zhuǎn)為嫩綠色。

A:為暗培養(yǎng)組培苗;B:為光培養(yǎng)組培苗。 圖3 光培養(yǎng)與暗培養(yǎng)對(duì)金釵石斛組培苗外觀性狀的影響

表2暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)組統(tǒng)計(jì)量

培養(yǎng)方式培養(yǎng)基幼苗量平均株高暗培養(yǎng)MS+土豆10g/L301.45±0.05**光培養(yǎng)MS+土豆10g/L301.22±0.04

**表示P<0.01。

2.1.4 激素組合對(duì)種子萌發(fā)的影響 將1至13號(hào)培養(yǎng)基種子萌發(fā)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，平均萌發(fā)周期由短到長(zhǎng)依次為：只加土豆(9d)、只加NAA(14.7d)、NAA與6-BA的組合(17.3d)、只加2,4-D(22.7d)、NAA添加土豆(28.3d)(見圖4A)，且只加土豆的培養(yǎng)基(13號(hào)培養(yǎng)基)萌發(fā)率最高達(dá)92.5%(見圖4B)。

A：為不同激素組合對(duì)金釵石斛種子萌發(fā)率的影響；B：為不同激素組合對(duì)金釵石斛種子萌發(fā)周期的影響。圖4 激素組合對(duì)種子萌發(fā)的影響

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 愈傷組織的誘導(dǎo)如表3所示，在MS基本培養(yǎng)基中僅加入2,4-D濃度為1 mg/L時(shí)可得到少量愈傷組織；當(dāng)僅加入NAA時(shí)，均不能誘導(dǎo)出愈傷組織，但在這兩種激素中還加入0.2 g/L碳顆粒時(shí)，均可誘導(dǎo)出愈傷組織，且在MS基本培養(yǎng)基中不加任何激素而僅添加碳顆粒時(shí)，可以誘導(dǎo)出大量疏松，淺黃綠色的愈傷組織(見圖5A)。進(jìn)一步觀察還發(fā)現(xiàn)，在不添加任何激素不加碳顆粒的14號(hào)培養(yǎng)基(對(duì)照)中，種子不會(huì)發(fā)育成愈傷組織而直接萌發(fā)為原球莖(見圖5B)。

A:金釵石斛愈傷組織；B:金釵石斛原球莖。圖5 碳粉對(duì)金釵石斛愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3植物激素種類與碳顆粒對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

編號(hào)植物激素含量(mg/L)2,4-DNAA顆粒含量(g/L)愈傷組織愈傷組織質(zhì)地10.2﹣﹣20.5﹣﹣31﹢致密,黃綠色,褐化較多40.2﹣﹣50.5﹣﹣61﹣﹣70.20.2﹢疏松,淡白色,水浸狀80.50.2﹢疏松,淡白色,水浸狀910.2﹢疏松,淡白色,顆粒狀100.20.2﹢疏松,淡白色,顆粒狀110.50.2﹢疏松,淡白色,顆粒狀1210.2﹢疏松,淡白色,顆粒狀130.2﹢﹢﹢疏松,淺黃綠色,顆粒狀14-﹣

“-”代表未誘導(dǎo)出愈傷組織，“﹢”代表愈傷組織誘導(dǎo)情況。

3 討論

金釵石斛種子細(xì)小，不含胚乳，僅有的胚中儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)成分無法滿足種子萌發(fā)所必需的全部養(yǎng)分，因此在自然條件下難以萌發(fā)(一般萌發(fā)率低于5%)，常需要與特殊真菌共生才能萌發(fā)[6]，這是其萌發(fā)率低的一個(gè)重要原因。本研究篩選出的最佳培養(yǎng)基可使金釵石斛種子萌發(fā)率達(dá)92.5%，這表明在非共生條件下，可以通過合理的調(diào)整培養(yǎng)基和激素的比例，為金釵石斛種子的萌發(fā)提供適宜的營(yíng)養(yǎng)成分，從而提高種子的萌發(fā)率，這為通過組培技術(shù)促進(jìn)金釵石斛種子萌發(fā)、實(shí)現(xiàn)快速繁殖提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

NAA可以提高種子中過氧化酶和過氧化氫酶的完整性，促進(jìn)種子萌發(fā)[7]。目前，利用NAA提高種子的萌發(fā)率已被廣泛應(yīng)用[8-9]。本研究通過對(duì)金釵石斛種子的萌發(fā)率分析，發(fā)現(xiàn)在以MS為基本培養(yǎng)基的前提下當(dāng)NAA濃度為1mg/L時(shí)種子萌發(fā)率較高為75%，萌發(fā)時(shí)間較短為14d，說明NAA對(duì)金釵石斛種子的萌發(fā)也有顯著的促進(jìn)作用。

有研究顯示天然添加物可以促進(jìn)金釵石斛壯苗和生根[10-11]，本研究發(fā)現(xiàn)，用成熟的金釵石斛種子為外植體，在單獨(dú)添加天然添加物土豆(10g/L)的條件下，金釵石斛種子的萌發(fā)率最高，萌發(fā)時(shí)間最短，說明天然添加物土豆在金釵石斛種子萌發(fā)階段發(fā)揮著重要的作用，這可能是由于土豆中含有的某些天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以為金釵石斛種子的萌發(fā)提供更為充分的養(yǎng)分。但在其它條件相同的情況下同時(shí)加入土豆和NAA則使金釵石斛種子的萌發(fā)受到了抑制(見圖2)，明顯低于單獨(dú)添加土豆和單獨(dú)添加NAA時(shí)的萌發(fā)率，產(chǎn)生這種情況的原因目前尚未見報(bào)道。由于高濃度的NAA可抑制種子的生長(zhǎng)[12]，因此我們推測(cè)可能是由于在種子萌發(fā)階段，土豆中含有的某些天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生了與生長(zhǎng)素NAA相類似的作用，兩種物質(zhì)同時(shí)加入導(dǎo)致激素濃度過高，從而抑制種子的萌發(fā)。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

金釵石斛種子在有碳顆粒存在的培養(yǎng)條件下，其萌發(fā)受到了明顯的抑制，而在沒有加入碳顆粒的培養(yǎng)基中，種子大多萌發(fā)生成原球莖，并逐漸分化出莖、葉、根，這和王紅梅的研究相吻合，他們的研究發(fā)現(xiàn)添加過量的碳粉會(huì)吸附大量培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，抑制了這些物質(zhì)發(fā)揮作用[13]。

同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)奶砑犹碱w?？梢杂行Т龠M(jìn)金釵石斛愈傷組織的生成。碳顆粒雖不能促進(jìn)種子萌發(fā)和生長(zhǎng)，但可明顯促進(jìn)愈傷組織的形成。在僅有碳顆粒存在的條件下金釵石斛種子可誘導(dǎo)出大量疏松、淺黃綠色的愈傷組織，這為利用組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)出金釵石斛愈傷組織提供了有意義的思路和參考。

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