二甲雙胍對(duì)糖尿病非酒精性脂肪性肝病大鼠G-6-Pase表達(dá)的影響

陳其榮 ，張安星，田浩明，高 琳，王 茜 ，張 晗

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563099；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院 內(nèi)分泌科，四川 成都 610041)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)以肝臟脂質(zhì)異位沉積為主要病理特征，已成為嚴(yán)重危害人們健康的三大肝臟病之一，其病因仍未明確，許多研究表明其與代謝綜合征關(guān)系密切，尤其是與肥胖、2型糖尿病和胰島素抵抗(IR)有關(guān)[1]。本實(shí)驗(yàn)研究高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠，并用二甲雙胍干預(yù)糖尿病模型組，探討SD大鼠不同糖代謝狀態(tài)下G-6-Pase mRNA的表達(dá)，同時(shí)觀察二甲雙胍對(duì)于糖尿病非酒精性脂肪性肝病的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠60只(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重為(180±20)g。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模及分組 60只SD大鼠，普通飼料喂養(yǎng)1周后：隨機(jī)選取15只為空白對(duì)照組,用普通飼料喂養(yǎng)，其余45只分為肥胖組(15只)、糖尿病組(15只)、二甲雙胍治療組(15只)，均以高脂高糖飼料喂養(yǎng)(配方為普通飼料62.5%，煉豬油20%，葡萄糖5%，蛋黃10%，膽固醇粉2%，膽酸鈉粉0.5%)。喂養(yǎng)12周后，禁食12h稱重，體重高于空白對(duì)照組平均體重20%為造模成功，成模12只。糖尿病組、二甲雙胍治療組高脂高糖喂養(yǎng)8周后禁食12 h，40 mg/kg一次性腹腔注射STZ(溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH4.4，終濃度1%)。1周后用強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀斷尾取血測(cè)空腹血糖，2次空腹血糖均≥16.7 mmol/L為糖尿病模型，共成模10只。二甲雙胍治療組予以鹽酸二甲雙胍(施貴寶公司)灌胃(100 mg/kg.d)2周，空腹血糖<11.1mmol/L為有效標(biāo)準(zhǔn)，共計(jì)9只。

1.2.2 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 血清游離脂肪酸、甘油三酯、總膽固醇用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)(Olympus AU2700型)，胰島素用放射免疫法測(cè)定(美國(guó)LINCO公司)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) G-6-Pase mRNA的表達(dá) 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取出肝臟約50 mg置于800 μL Trizol中，-80 ℃冰箱凍存。使用美國(guó)BIO-RAD公司icycler熒光定量PCR儀，G-6-Pase mRNA上游引物5′-AACGTCTGTCTGTCCCGGATCTAC-3′，下游引物5′-ACCTCTGGAGGCTGGCATTG3′，β-actin上游引物5′-CCACAGACACAGGCACTGATGA-3′，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。結(jié)果分析采用相對(duì)定量法，以PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(cycle threshold Ct值)為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，平均Ct值=(Ct1+Ct2)/2，dCt=平均Ct值-中間值，目的基因的表達(dá)=2-dCt，相對(duì)定量值=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)。

1.2.4 肝臟病理學(xué)觀察 取相同部位小塊肝臟，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。以《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[1]為病理診斷參考標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠血液學(xué)指標(biāo)比較(見(jiàn)表1)

2.2 G-6-Pase mRNA表達(dá) 比較肥胖組大鼠肝臟G-6-Pase mRNA較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糖尿病組G-6-Pase mRNA較肥胖組顯著增高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二甲雙胍治療組G-6-Pase mRNA較糖尿病組顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

組別例數(shù) FBG(mmol/L)FFA(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)Fins(mIU/L)ISI正常對(duì)照組10 4.28±1.05375±1630.24±0.091.20±0.320.54±0.150.37±0.1310.40±3.250.03±0.01 肥胖組12 5.31±0.57479±1511.13±0.48△1.59±0.410.65±0.130.44±0.2224.45±8.77△0.01±0.005△糖尿病組10 25.52±2.75△●1260±588△#6.65±3.07△●6.71±3.27*1.04±0.29△●3.66±1.57*#38.18±9.11△● 0.001±0.0002△●二甲雙胍組9 6.97±1.35★ 646.56±192.97* 1.55±0.61△★ 1.80±0.33△ 0.75±0.19*★ 0.47±0.19☆——

FBG:空腹血糖；FFA:游離脂肪酸；TG:甘油三酯；TC:總膽固醇；HDL:高密度脂蛋白膽固醇；LDL：低密度脂蛋白膽固醇；Fins:空腹胰島素；ISI:胰島素敏感指數(shù)vs.GroupA,*P<0.05, △P<0.01;vs.GroupB,#P<0.05,●P<0.01;vs.GroupC, ☆P<0.05,★P<0.01;vs.GroupD,◇P<0.05,★P<0.01。

組別例數(shù)G-6-Pase mRNA / β-actin空白對(duì)照組101.32±0.395肥胖組120.35±0.075△糖尿病組10 1.59±0.39●二甲雙胍治療組91.08±0.262#☆

與空白組比較,*P<0.05,△P<0.01;與肥胖組比較,#P<0.05,●P<0.01;與糖尿病組比較,☆P<0.05,★P<0.01。

2.3 肝臟病理學(xué)變化 正常組大鼠肝臟組織小葉形態(tài)正常，無(wú)肝細(xì)胞水腫、脂肪變性及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肥胖組大鼠肝組織小葉形態(tài)完整，但出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫(肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松、氣球樣變)、脂肪變性(肝細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)脂滴空泡)；糖尿病組大鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞彌漫性水腫,廣泛性脂肪變性，即為糖尿病非酒精性脂肪肝病。二甲雙胍治療組見(jiàn)少量肝細(xì)胞脂肪變性及肝細(xì)胞水腫(見(jiàn)圖2)。

A:正常組;B:肥胖組;C:糖尿病組;D:二甲雙胍組。圖2 4組大鼠肝臟病理圖片(HE×200)

3 討論

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被認(rèn)為是最常見(jiàn)的肝臟疾病之一，包括從簡(jiǎn)單的脂肪變到非酒精性脂肪性肝炎，最終導(dǎo)致肝硬化[2]。盡管NAFLD的病理生理機(jī)制尚未完全弄清，但公認(rèn)胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)在其發(fā)生發(fā)展中起了關(guān)鍵作用，到目前為止，“二次打擊”學(xué)說(shuō)為學(xué)者們廣泛接受。

本實(shí)驗(yàn)糖尿病組血糖、血脂、游離脂肪酸及空腹胰島素均較空白組升高，胰島素敏感指數(shù)明顯降低，說(shuō)明糖尿病大鼠存在明顯的胰島素抵抗。并且糖尿病大鼠肝組織G-6-Pase mRNA含量較空白組增加，二甲雙胍干預(yù)后，G-6-Pase mRNA含量明顯降低，肝組織病理結(jié)果表明DM組大鼠出現(xiàn)明顯的脂肪變性合并炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及纖維化，與之對(duì)應(yīng)的是G-6-Pase在糖尿病大鼠肝組織中表達(dá)增高，與肝臟病變的程度一致，提示可能與NAFLD的發(fā)展相關(guān)，我們的結(jié)果支持 G-6-Pase可能與糖尿病非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與Kim、Lee等人研究相符[3-4]，二甲雙胍可能通過(guò)降低G-6-Pase的表達(dá)，抑制糖異生，從而改善脂肪肝。研究證實(shí)二甲雙胍通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途徑上調(diào)SHP基因表達(dá)，同時(shí)增加的SHP基因抑制G-6-P 的表達(dá)，減低糖異生。多項(xiàng)研究表明，二甲雙胍作為胰島素的增敏劑，改善糖脂代謝紊亂，有效地改善NAFLD及其代謝狀態(tài)[5]。二甲雙胍能改善NAFLD，主要通過(guò)減少肝細(xì)胞脂肪沉積和抑制炎癥反應(yīng)[6]，也可能與二甲雙胍下調(diào)分泌磷脂酶A2 mRNA的表達(dá), 從而降低炎癥反應(yīng)和保護(hù)線粒體功能有關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)空白組無(wú)肝臟脂肪變，二甲雙胍治療組有輕微脂肪變，然而空白組G-6-Pase mRNA含量卻高于二甲雙胍治療組，考慮G-6-Pase只是非酒精性脂肪肝的一個(gè)因素，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究中公認(rèn)的因素有：①胰島素抵抗；②體內(nèi)氧化應(yīng)激；③庫(kù)普弗細(xì)胞與細(xì)胞因子；④脂代謝紊亂。

本實(shí)驗(yàn)肥胖組大鼠肝組織G-6-Pase mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下降，與一些文獻(xiàn)不符，考慮其原因與機(jī)體的肝X 受體(LXR)有關(guān)，董瑩等認(rèn)為在非糖尿病階段，LXR 可能作為糖代謝的保護(hù)性受體,通過(guò)調(diào)節(jié)肝糖代謝酶,即機(jī)體調(diào)節(jié)G-6-Pase、PEPCK的表達(dá)，使肝臟糖異生作用減弱，肝糖輸出減少，是機(jī)體的一種保護(hù)性代償，以達(dá)到延緩糖尿病的發(fā)生、發(fā)展的目的[8]。進(jìn)入糖尿病階段后,其胰島素分泌嚴(yán)重不足,從而無(wú)法抑制肝內(nèi)G-6-Pase的轉(zhuǎn)錄,此時(shí)LXR 的保護(hù)作用并不能逆轉(zhuǎn)因胰島素不足所致的糖代謝相關(guān)酶的異常改變,血糖不能恢復(fù)正常。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病組大鼠肝臟G-6-Pase mRNA的表達(dá)較肥胖組顯著增高，說(shuō)明糖尿病大鼠已不能依靠自身的生理性調(diào)節(jié)保證血糖穩(wěn)定，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。

總之，二甲雙胍可改善糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂，增加胰島素敏感性，減輕非酒精性脂肪肝的病理?yè)p害, 對(duì)糖尿病及NAFLD患者積極予二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)，可能有助于改善和延緩糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展。

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