柱花草膠孢炭疽菌致病力鑒定和致病類型分析

易克賢　鄭金龍　賀春萍　習(xí)金根　高建明　張世清　陳河龍　劉巧蓮

摘 要 用2套鑒別寄主分別對47份A型菌和57份B型菌的致病力進行鑒定，研究表明，不同的柱花草炭疽病菌株致病力不同。應(yīng)用最大似然法（EML法）對鑒別寄主的致病力鑒定結(jié)果進行聚類分析，A型菌可劃分成3大小種類型，且其聚類非常緊湊，表現(xiàn)出一定的寄生?；?；而B型菌可劃分成2大小種類型，但其在型內(nèi)分化較為復(fù)雜，說明B型菌將來有可能分化出更多的小種類型。從地區(qū)而言，無論A型菌還是B型菌均表現(xiàn)為海南菌株的致病力最強，其中尤以昌江和東方的菌株致病力最強。因而對病原變異和進化動態(tài)的監(jiān)測十分必要。

關(guān)鍵詞 柱花草 ；炭疽病 ；致病力 ；鑒定 ；分析

分類號 S435.4

柱花草（Stylosanthes spp.）又名筆花豆，天然分布在中南美洲、熱帶北美洲、非洲及東南亞[1]。柱花草是熱帶、亞熱帶地區(qū)的優(yōu)質(zhì)牧草，具有很大的發(fā)展?jié)摿2]。作為放牧和刈割兼用型牧草，中國于1961年首次將疏毛柱花草（Stylosanthes gracilis Kunth.）作為幼齡橡膠園等種植園的綠肥覆蓋材料成功引入，起初表現(xiàn)良好，后因易感炭疽病而頻臨毀滅[3-9]。柱花草炭疽病（Stylo anthracnose）是目前嚴重影響柱花草生產(chǎn)和推廣的主要病害，該病可造成牧草葉片變黃、壞死脫落，莖和葉柄枯萎，花序敗落不結(jié)籽，嚴重時使幼苗和整個成株死亡，牧草產(chǎn)量和種子產(chǎn)量銳減甚至絕收。中國自推廣種植柱花草以來，由于受到柱花草炭疽病的危害，其產(chǎn)量受到嚴重影響[10]。柱花草炭疽病病原菌存在高度的生物多樣性和遺傳變異性[11]，同一品種的柱花草在不同地點的感染程度有異；而且一個抗病的柱花草品種使用3～5 a后就會變成感病品種，即品種抗病壽命一般只有5 a左右[12]。柱花草炭疽病病原菌的地理分布與柱花草宿主的自然分布相關(guān)。據(jù)筆者1997年對中國廣東、廣西、海南3省的14個主要柱花草生產(chǎn)市縣進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)中國柱花草同時存在A、B 2種專化型[2]。由于中國目前推廣種植的柱花草主要是圭亞那種，因此危害中國柱花草的主要是B型膠孢炭疽菌，但其小種尚不清楚。因此，本研究對柱花草炭疽菌進行致病力鑒定和致病類型分析，為有效控制該病流行打下基礎(chǔ)，也為篩選高抗炭疽病的育種材料和基因資源提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

鑒定的病原菌材料共104份，其中A型菌47份、B型菌57份，A型菌用柱花草品種Seca（40292），36260，Q10042，93116，2323，2534，2539，F(xiàn)itzroy，Endeavour（為交叉鑒別寄主）作鑒別寄主； B型菌用Endeavour，Schofield，Cook，Graham，Oxley，F(xiàn)itzroy（為交叉鑒別寄主）作鑒別寄主。

供鑒定的A型菌株：CH306，CH100，CH224，CH247，CH237，CH275，CH243，CH076，CH349，CH311 CH286，CH242，CH269，CH231，CH235，CH292，CH295，CH058 CH293 CH321 CH087，CH378，CH288，CH505，CH345，CH506，CH512，CH377，CH504，CH509，CH508，CH110，CH036，CH343，CH502，CH511，CH501，CH380，CH379，CH513，CH163，CH376，CH089，CH026，CH691，CH693，CH037；

供鑒定的B型菌株：CH055，CH052，CH011，CH025，CH066，CH016，CH115，CH005，CH018，CH004，CH251，CH100，CH002，CH013，CH008，CH003，CH111，CH010，CH020，CH024，CH026，CH238，CH021，CH118，CH014，CH290，CH253，CH362，CH023，CH678，CH690，CH698，CH674，CH683，CH687，CH697，CH684，CH679，CH451，CH696，CH700，CH669，CH691，CH702，CH484，CH672，CH699，CH670，CH542，CH675，CH526，CH694，CH452，CH450，CH671，CH695，CH677。

1.2 方法

試驗工作流程：鑒別寄主種子和苗床土壤基質(zhì)準(zhǔn)備→播種→苗期管理→病原菌繁殖→接種→病情嚴重度評定→數(shù)據(jù)分析

1.2.1 準(zhǔn)備寄主種子和苗床土壤基質(zhì)

挑選足夠的專門繁殖的寄主種子，用細砂布輕輕擦破種皮，以利種子萌發(fā)。

將消毒好的砂土均勻裝入育苗盤或杯至一半高度，然后再用消毒好的混合土（表土∶砂=2∶1）裝滿剩余的一半。

1.2.2 播種

2005年3月播種，隨機區(qū)組設(shè)計，重復(fù)3次。首先插入標(biāo)簽，然后按標(biāo)簽正確播種，每杯播種2～3粒。

1.2.3 苗期管理

播后初次澆水施用多菌靈或苯來特，以防幼苗枯萎病。每天檢查苗床濕度情況并及時澆水，通常每天澆水1次，注意不要過量。每2周用NPK專用肥溶于水中澆1次。當(dāng)苗長至10 cm時間苗1次，每杯留苗1株。

1.2.4 炭疽菌繁殖

在接種前2周，即播種后的第5周，用PDA培養(yǎng)基擴繁待試的炭疽菌。

1.2.5 接種

播種后第6周開始接種。用毛刷輕輕洗下培養(yǎng)基上的孢子，再用滅菌水配成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度為1.0×106個孢子/mL，立即用小噴霧器噴霧接種。接種后將育苗盤移入水盆中并用有機透明玻璃罩或塑料罩罩住，在飽和濕度下保濕生長48 h后，除去水盆和罩子，再按接種前苗期管理程序操作。

1.2.6 病情嚴重度評價

接種14 d后，根據(jù) Horsfall-Barrat 的分類標(biāo)準(zhǔn)[13]，按0～9級分級法對幼苗發(fā)病情況進行評定，計算病情指數(shù)。病情指數(shù)計算公式：病情指數(shù)=100×∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值）。病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)如下：endprint

0級 無可見病斑；

1級 1～3%葉片或莖段有病斑；

2級 4～6%葉片或莖段有病斑；

3級 7～12%葉片或莖段有病斑；

4級 13～25%葉片或莖段有病斑；

5級 26～50%葉片或莖段有病斑；

6級 51～75%葉片或莖段有病斑；

7級 76～87%葉片或莖段有病斑；

8級 88～94%葉片或莖段有病斑；

9級 95～100%葉片或莖段有病斑。

2 結(jié)果與分析

不同的柱花草炭疽病菌株致病力不同。應(yīng)用最大似然法（EML法）對鑒別寄主的致病力鑒定結(jié)果進行聚類分析，A型菌在值-900處可劃分成3大小種類型，而B型菌在值-600處可劃分成2大小種類型（圖1、2）。2002年，筆者曾對25個A型菌進行過毒力鑒定，并將有關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)往澳大利亞熱帶植物病理學(xué)研究中心（CRCTPP）與其他國家的相關(guān)鑒定材料進行縱向綜合分析，澳大利亞專家認為可能存在5個小種類型[14]。

從A型菌看，A型菌表現(xiàn)為一定的寄生?；?，主要侵染粗糙柱花草、有鉤柱花草，特別是A-3類菌株沒有發(fā)現(xiàn)侵染圭亞那種柱花草，僅侵染粗糙柱花草（表1、5）。從地區(qū)而言，海南3類菌株均有，而廣東僅有A-2類菌株（表3）。從致病力來看，A-3類所有的菌株致病力都是測試菌株中最強的，且A-3、A-1類菌株均為海南所特有。海南菌株在3省區(qū)中致病力最強，尤其以儋州CH0288、CH0292、CH0275、CH0237、CH0247、CH0306、東方CH0087、昌江CH0037菌株致病力最強，廣東的CH0505菌株在后期的侵染較強，廣西菌株致病力最弱（圖1、表7）。值得特別注意的是CH0306，該菌株能侵染較抗病的西布拉柱花草新種質(zhì)2534，有可能在將來形成強大的威脅。

從B型菌看，2類菌株均在3省區(qū)有分布（表2）。B型菌主要侵染圭亞那種柱花草（表4、6）。2類菌株中以B-2類的致病力最強，B-1類較弱，其中供試菌株中致病力最強的前10個菌株CH700、CH698、CH687、CH678、CH100、CH683、CH026、CH362、CH066、CH118全部出現(xiàn)在B-2類中。從地區(qū)而言，來自海南的菌株致病力最強，其中尤其以昌江和東方的菌株致力最強（圖2，表8）。

3 討論與結(jié)論

了解病原菌群體內(nèi)致病性的分化或變異情況，對制定防治對策和指導(dǎo)抗病育種具有重要意義。本研究結(jié)果表明：不同的柱花草炭疽病菌株致病力不同；從致病力鑒定結(jié)果看，A型菌存在3大致病類型，B型菌存在3大致病類型；但從聚類圖看，A型菌聚類非常緊湊，而B型菌在型內(nèi)分化較為復(fù)雜，說明A型菌具有一定的寄生?；?，而B型菌將來有可能分化出更多的小種類型。因而對病原變異和進化的動態(tài)監(jiān)測十分必要。

將本研究的病原毒性鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記分析結(jié)果進行對比分析，可發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)致病力最強的菌株均來自于海南，有A-3類、B-2類菌株。因此，在海南特別是在昌江、東方、儋州進行柱花草種子生產(chǎn)時，必須引起足夠的重視，種子生產(chǎn)應(yīng)盡可能避開上述地區(qū)，同時對出售的種子應(yīng)進行嚴格的消毒和檢疫。

關(guān)于病菌群體毒性與DNA多態(tài)性的相互關(guān)系研究有許多文獻提及。一般認為一些寄生程度較低的植物病原真菌的DNA多態(tài)性和毒性多態(tài)性大都存在較好的相關(guān)性，對于具有高度專性的活體營養(yǎng)菌如銹菌、白粉菌等的研究結(jié)果則不盡一致。Chakraborty等認為，柱花草炭疽菌毒性與DNA多態(tài)性之間無明顯的關(guān)系[11]。由此看來，不同真菌種類的毒性與DNA多態(tài)性之間存在甚為復(fù)雜的關(guān)系，因為致病力的強弱除與病原本身遺傳有關(guān)外，還與寄主、環(huán)境有強烈的相互作用，并在一定程度上還受到人為因素的影響，因此弄清各自的特點，對于深入研究病原致病性的遺傳和變異至關(guān)重要。

參考文獻

[1] Edye L A， Cameron D F. Prospects for Stylosanthes improvement and utilization.In： Stace H M， Edye L A， The biology and agronomy of Stylosanthes[M]. Academic Press， North Ryde， NSW， Australia， 1984：571-587.

[2] 易克賢. 柱花草炭疽病及其抗病育種進展[J]. 中國草地，2001，22（4）：59-65.

[3] 唐湘梧. 熱帶北緣早熟抗病柱花草選育研究[J]. 熱帶作物學(xué)報，1996，16（2）：103-109.

[4] Edye L A. Commercial development of Stylosanthes pastures in northern Australia I： Cultivar development within Stylosanthes in Australia[J]. Tropical Grasslands， 1997， 31： 5 032-5 081.

[5] 唐湘梧，邢治能，何華玄，等. 海南島唐馬園飛播牧草技術(shù)總結(jié)[J]. 中國草業(yè)科學(xué)，1988（1）：40-44.

[6] Australian Center of International Agriculture Research （ACIAR）. Project summary of use of high yielding anthracnose resistance Stylosanthes for sustainable agriculture systems[M]. Canberra：ACIAR， 1996： 14-18.endprint

[7] Cameron D F. Use of natural out crossing to improve the anthracnose resistance of Stylosanthes guianensis Special publication [J]. Agronomy Society of New Zealand， 1986， 5： 224-227.

[8] Guodao L， Phaikaew C， Stur W W. Status of Stylosanthes development in other countries.Ⅱ. Stylosanthes development and utilization in China and South-east Asia [J]. Tropical Grasslands， 1997， 31： 460-466.

[9] Chakraborty S. Expression of quantitative resistance to Colletotrichum gloeosporioides in Stylosanthes scabra at different inoculum concentrations and day-night temperatures[J]. Australian Journal of Agricultural Research， 1990， 41： 89-100.

[10] 馮淑芬，李鳳娥，何朝族，等. 筆花豆炭疽病菌生物學(xué)特性和流行條件研究[J]. 熱帶作物學(xué)報，1994，15（1）：87-94.

[11] Chakraborty S， Perrott R， Charchar M J D A， et al. Biodiversity， epidemiology and virulence of Colletotrichum gloeosporioides.Ⅱ.Genetic and pathogenic diversity in isolates of Colletotrichum gloeosporioides from eight species of Stylosanthes[J]. Tropical Grasslands， 1997， 31： 393-401.

[12] 白昌軍，劉國道，陳志權(quán)，等. 熱研20號太空柱花草選育研究報告[J]. 熱帶作物學(xué)報，2011，32（1）：33-41.

[13] Horsfall JG，Barratt R W. An improved grading system for measuring plant diseases[J]. Phytopathology， 1945， 35： 655.

[14] Chakraborty S，Pangga I B，Lupton J， et al. Production and dispersal of Colletotrichum gloeosporioides spores on Stylosanthes scabra under elevated CO2 [J]. Environmental Pollution， 2004， 108（3）： 381-387.endprint