分子標(biāo)記在菠蘿研究中的應(yīng)用

馬帥鵬等

摘 要 介紹了分子標(biāo)記技術(shù)在菠蘿上的應(yīng)用，主要包括種質(zhì)鑒別、遺傳多樣性、親緣關(guān)系、連鎖圖譜構(gòu)建以及與優(yōu)良農(nóng)藝性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得等方面的情況，并對(duì)存在的問題和應(yīng)用前景進(jìn)行了討論。

關(guān)鍵詞 分子標(biāo)記 ；菠蘿 ；應(yīng)用

分類號(hào) S668.3

Abstract This paper summarizes the application of molecular markers in the research of pineapple，mainly including identification，genetic diversity，genetic map construction，achievement of molecular markers that were closely linked to the target genes. At last，we discuss the problems and prospects of the application.

Keywords molecular markers ； pineapple ； application

菠蘿是鳳梨科（Bromeliaceae）鳳梨屬（Ananas）多年生草本果樹，與荔枝、香蕉、木瓜合稱我國(guó)嶺南四大名果。菠蘿在世界熱帶水果中占有重要的位置，其產(chǎn)量?jī)H次于香蕉和柑橘，位居第三[1]。與其它的熱帶果樹相比，菠蘿在利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性、親緣關(guān)系以及開發(fā)與優(yōu)良性狀相關(guān)標(biāo)記等領(lǐng)域的研究起步較晚。

目前菠蘿的分類方法有多種，主要依據(jù)都是形態(tài)特征，而這些形態(tài)特征往往容易受到環(huán)境的影響。另外，部分栽培品種名稱叫法不一，嚴(yán)重阻礙了菠蘿的育種改良。所以選擇一種準(zhǔn)確可靠又能真實(shí)反映種質(zhì)特性的分類方法就顯得十分必要。分子標(biāo)記直接以物種的遺傳物質(zhì)DNA為研究對(duì)象，與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類相比具有不受取材部位、發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響等優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)從DNA水平對(duì)菠蘿種質(zhì)資源進(jìn)行整理分析，可為菠蘿的合理利用提供理論依據(jù)。本文從分子標(biāo)記技術(shù)在菠蘿中的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景方面進(jìn)行綜述討論。

1 分子標(biāo)記在菠蘿上的應(yīng)用

1.1 菠蘿品種鑒定

菠蘿原產(chǎn)南美洲，17世紀(jì)由葡萄牙人傳入澳門，后陸續(xù)傳到廣東、廣西、海南、臺(tái)灣等地。在長(zhǎng)期的傳播過程中和復(fù)雜的文化背景下產(chǎn)生了同名異物或者同物異名的現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了菠蘿種質(zhì)資源的合理利用和育種進(jìn)程。分子指紋圖譜直接反映DNA水平上的差異，不受外部環(huán)境的影響，具有個(gè)體特異性，能夠快速準(zhǔn)確地鑒定不同的品種。分子指紋已經(jīng)對(duì)多種果樹進(jìn)行了有效鑒別，王靜毅等[2]利用SSR建立了部分香蕉的指紋圖譜，祝軍等[3]對(duì)蘋果進(jìn)行AFLP分析并得到了蘋果的指紋圖譜，王壯偉等[4]建立了部分歐美草莓的指紋圖譜，雷天剛等[5]利用SSR和ISSR建立柑橘的DNA指紋圖譜，劉孟軍等[6]利用RAPD成功區(qū)分了親緣關(guān)系很近的無核小棗和金絲小棗，這說明分子指紋圖譜也可用于遺傳背景非常相似的種質(zhì)鑒別。童和林等[7]篩選5對(duì)多態(tài)性較高條帶清晰的SSR引物擴(kuò)增31份菠蘿種質(zhì)的DNA片段，根據(jù)條帶特征初步構(gòu)建了菠蘿的SSR分子指紋圖譜，并且利用EP-13、EP-15和EP-20 3對(duì)引物就可以將31份菠蘿種質(zhì)全部區(qū)分。張如蓮等[8]利用ISSR分子標(biāo)記得到了6 個(gè)菠蘿品種的特異性擴(kuò)增帶。劉衛(wèi)國(guó)等[9]利用AFLP確定了在廣東徐聞栽培的夏威夷和無刺卡因以及黃金和多汁為同物異名，夏威夷-2號(hào)不是夏威夷品種屬于同名異物。Topik等[10]利用ITS成功地區(qū)分了馬來西亞的9個(gè)栽培品種。雖然分子指紋圖譜構(gòu)建的方法可能不同，但在菠蘿的種質(zhì)鑒別方面已經(jīng)得到了有效的應(yīng)用，也成功地區(qū)分了同名異物和同物異名。種質(zhì)的鑒定區(qū)分可以合理的定位每份種質(zhì)資源在該物種系統(tǒng)中的位置，方便種質(zhì)的篩選利用。分子標(biāo)記技術(shù)成功地區(qū)分了不同的種質(zhì)資源，可以作為品種保護(hù)鑒定和新品種登記的重要手段和依據(jù)。

1.2 遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析

菠蘿的遺傳背景比較復(fù)雜，摸清不同種質(zhì)的遺傳多樣性對(duì)于菠蘿育種進(jìn)程有重要的指導(dǎo)意義，尤其在雜交育種親本選擇方面。利用分子標(biāo)記可以確定親本之間的遺傳差異，選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的父母本進(jìn)而提高雜交優(yōu)勢(shì)的潛力?？傮w而言，國(guó)內(nèi)外利用分子標(biāo)記對(duì)菠蘿進(jìn)行研究的報(bào)道偏少。Aradhya等[11]利用同工酶對(duì)菠蘿進(jìn)行了聚類和多樣性分析。Fatima等[12]利用RAPD對(duì)菠蘿的18份種質(zhì)進(jìn)行多樣性分析，共得到148個(gè)位點(diǎn)，其中132個(gè)具有多態(tài)性，多態(tài)率達(dá)到89.2%。1991年，Noyer等[13]首次將RFLP分子標(biāo)記應(yīng)用在菠蘿上。Duval等[14]利用RFLP對(duì)食用菠蘿屬的7個(gè)種和擬菠蘿屬共301份種質(zhì)進(jìn)行了親緣關(guān)系和遺傳多樣性評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬菠蘿屬的供試材料的遺傳多樣性較高，雖然食用菠蘿屬種質(zhì)在形態(tài)學(xué)上差別較大，但是遺傳多樣性偏低。研究結(jié)果還指出通過對(duì)葉綠體DNA限制性位點(diǎn)變異進(jìn)行研究可以更好地揭示菠蘿和近緣屬的進(jìn)化演變關(guān)系。邱文武等[15]建立并優(yōu)化了適合菠蘿的SRAP反應(yīng)體系。竇美安等[16]利用SRAP標(biāo)記研究了61份菠蘿種質(zhì)資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)菠蘿品種的遺傳多樣性水平較低，在相似系數(shù)0.84處將供試材料分成5組，該研究結(jié)果基本和形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致，也有部分品種的分類結(jié)果和傳統(tǒng)分類結(jié)果有差異，可以結(jié)合形態(tài)學(xué)特征綜合考慮更為合理。

隨著DNA分子技術(shù)的發(fā)展，更加高效的AFLP逐步被采用。Kato等[17]利用AFLP對(duì)148份菠蘿種質(zhì)和14份近緣種進(jìn)行親緣關(guān)系分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相似系數(shù)的范圍0.549～0.972，說明供試樣品遺傳多樣性較高，與竇美安等[16]的結(jié)果有差異。Paz等[18]研究發(fā)現(xiàn)，墨西哥的菠蘿種質(zhì)資源遺傳多樣性較低，根據(jù)形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果和AFLP分類的結(jié)果很一致。在國(guó)內(nèi)，劉衛(wèi)國(guó)等[19]改良了菠蘿的DAN的提取方法得到了質(zhì)量較好的DNA并建立優(yōu)化了AFLP反應(yīng)體系。2008年劉衛(wèi)國(guó)等[9]又篩選8對(duì)引物對(duì)39份菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了AFLP分析，多態(tài)性條帶平均為73.1%，相似系數(shù)為0.73～0.98，在相似系數(shù)0.8處將供試材料分成4組，為供試材料的合理利用提供了理論依據(jù)，這也是國(guó)內(nèi)首次將AFLP應(yīng)用到菠蘿上。童和林等[7]采用SAM法以臺(tái)農(nóng)17號(hào)作為實(shí)驗(yàn)材料開發(fā)了多態(tài)性較高的菠蘿SSR引物，F(xiàn)eng等[20]對(duì)開發(fā)的SSR引物進(jìn)行了MISA軟件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在得到的94個(gè)位點(diǎn)中有91個(gè)二核苷酸重復(fù)，3個(gè)單核苷酸重復(fù)，沒有發(fā)現(xiàn)3個(gè)及3個(gè)以上的核苷酸重復(fù)，并篩選到了13對(duì)多態(tài)性較好的引物，可用于菠蘿遺傳多樣性研究。Shoda等[21]僅利用3對(duì)SSR引物就可以將30份菠蘿種質(zhì)資源區(qū)分開來，并且發(fā)現(xiàn)供試材料具有較高的遺傳多樣性。Rodrigueza等[22]設(shè)計(jì)了10對(duì)SSR引物對(duì)6個(gè)主栽品種的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到26個(gè)多態(tài)性的等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)有2.6個(gè)等位基因。張如蓮等[8]利用 6對(duì)ISSR 引物對(duì) 17份菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了基因組 DNA 多態(tài)性分析，共擴(kuò)增出70個(gè)條帶，多態(tài)性條帶44條，多態(tài)性62.86%。在相似系數(shù)約0.1處可將供試材料分成3大類。Vanijajiva[23]篩選9對(duì)引物對(duì)15個(gè)泰國(guó)菠蘿品種進(jìn)行ISSR分析，得到56個(gè)條帶其中27個(gè)具有多態(tài)性，相似系數(shù)為0.316～0.968，遺傳多樣性水平較高。Zhang等[24]利用ISSR對(duì)40份來自4個(gè)不同屬的鳳梨科植物進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，得到的結(jié)果和按照植物學(xué)分類的結(jié)果相吻合。綜上所述，他們對(duì)菠蘿種質(zhì)遺傳多樣高低的評(píng)價(jià)有較大差異，相似系數(shù)的范圍也差異明顯，這可能與供試樣品的選擇有關(guān)。endprint

1.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

遺傳連鎖圖譜是基因組研究的基礎(chǔ)，也是基因定位與克隆和分子輔助育種的有效工具。番木瓜[25]、荔枝[26]、蘋果[27]、咖啡[28]、腰果[29]等作物的連鎖圖譜繪制都已完成。2004年Carlier等[30]繪制了菠蘿的第一張連鎖圖譜，后來又進(jìn)行了大量的改進(jìn)補(bǔ)充。2012年Carlier等[31]繪制了相對(duì)比較完整的菠蘿的遺傳連鎖圖譜，共33個(gè)連鎖群，492個(gè)位點(diǎn)（348 個(gè)AFLP、57個(gè)RAPD、25個(gè)SCAR、22個(gè)ISSR、20個(gè)SSR、12個(gè)EST-SSR、8個(gè)CAPS以及一些形態(tài)特征位點(diǎn)）。2013年Sousa和Carlier等[32]又對(duì)以前的連鎖圖譜進(jìn)行了補(bǔ)充，覆蓋位點(diǎn)達(dá)到741個(gè)，其中包括739個(gè)DNA位點(diǎn)、1個(gè)同工酶位點(diǎn)和1個(gè)編碼葉片無刺的“piping”位點(diǎn)。覆蓋位點(diǎn)從最初的156個(gè)發(fā)展到739個(gè)，基因組的覆蓋率從31.6%發(fā)展到約86%?？傮w而言，菠蘿連鎖圖譜的繪制取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是農(nóng)藝性狀的具體分布仍需進(jìn)一步研究。趙玉輝等[33]根據(jù)繪制的荔枝遺傳連鎖圖譜找到了與荔枝的酒石酸、蘋果酸、蔗糖含量和單果重相連鎖的QTL位點(diǎn)并進(jìn)行了定位。張瑞萍等[34]利用區(qū)間作圖法進(jìn)行了梨的可溶性固形物和果實(shí)縱橫徑等的QTL定位，這為菠蘿的QTL定位研究指明了方向。利用目前繪制的菠蘿遺傳連鎖圖譜可對(duì)菠蘿以及鳳梨科的其他物種的生理和育種開展大量的研究工作，特別是在分子輔助育種、基因的克隆定位以及QTL領(lǐng)域。

1.4 與優(yōu)良農(nóng)藝性狀相關(guān)的分子標(biāo)記鑒定

定位和克隆與重要的經(jīng)濟(jì)性狀相連鎖的基因并對(duì)其實(shí)施調(diào)控是我們進(jìn)行遺傳改良的重要途徑。果樹農(nóng)藝性狀基因標(biāo)記篩選的主要方法包括：混合分離分析法（BSA）、平行芽變分析法（PSA）和已知信息捕捉法（KIH）[35]。通過已獲得的農(nóng)藝性狀基因的分子標(biāo)記可以進(jìn)行基因圖位克隆和輔助育種等多個(gè)領(lǐng)域，有力地縮短育種進(jìn)程，提高育種效率。目前已經(jīng)篩選出了很多與果樹農(nóng)藝性狀基因相關(guān)的分子標(biāo)記，如蘋果的抗黑星病基因[36]、開花時(shí)間[37]和托葉形態(tài)[38]等；桃的果形和酸度[39]等；草莓的紅中柱抗性[40]。菠蘿主要利用無性系保存和繁育，很多新品種是通過芽變選種得到的，母株和芽變植株的基因差別很小，適合采用近等基因系法進(jìn)行研究。在荔枝研究方面，劉成明等[41]已經(jīng)對(duì)親緣關(guān)系非常近的‘懷枝、‘三月紅及其焦核突變體進(jìn)行了相似的研究并獲得了相關(guān)的分子標(biāo)記。可以通過集團(tuán)混合分離分析法對(duì)同一菠蘿品種不同個(gè)體之間葉緣刺有無的相關(guān)基因和抗病基因等進(jìn)行篩選，也可以通過對(duì)已知相近物種標(biāo)記的保守序列信息進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增雜交進(jìn)而獲得菠蘿相應(yīng)性狀的分子標(biāo)記。菠蘿的抗寒性和抗病性等重要農(nóng)藝性狀基因需要進(jìn)一步地開發(fā)挖掘定位并應(yīng)用到菠蘿的遺傳育種進(jìn)程中，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行定位克隆和早期篩選會(huì)是今后研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

2 存在的問題和前景

根據(jù)前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，栽培菠蘿遺傳基礎(chǔ)狹窄[16]，遺傳多樣性水平較低[9]，種質(zhì)創(chuàng)新的進(jìn)程中可以考慮適當(dāng)引入親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的近緣種。鳳梨科包括56屬3 000種[42]，是一個(gè)龐大的資源庫(kù)，菠蘿相近物種的挖掘可以有效地進(jìn)行菠蘿的種質(zhì)創(chuàng)新利用。野生近緣種可能保存著栽培種沒有或者已經(jīng)消失的優(yōu)良基因，是菠蘿育種的寶貴資源。菠蘿后代的性狀分離現(xiàn)象比較明顯，即使同一品種的營(yíng)養(yǎng)繁殖和組培快繁后代也會(huì)出現(xiàn)性狀差異，產(chǎn)生了許多表型突變體，Collins[43]發(fā)現(xiàn)40多種葉、花、果實(shí)的突變體。分子標(biāo)記可從分子水平準(zhǔn)確地鑒別體細(xì)胞的無性變異，Wang等[44]可以利用AFLP輕松區(qū)分來自不同細(xì)胞系的體細(xì)胞胚。

前人利用多種分子標(biāo)記對(duì)菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了聚類分析，不同的分子標(biāo)記的結(jié)果也有差異。劉衛(wèi)國(guó)[19]和竇美安[16]分別采用AFLP和SRAP對(duì)土種無刺的歸屬就出現(xiàn)了分歧，前者將其劃入無刺卡因類后者將其劃入西班牙類。這可能與不同標(biāo)記的擴(kuò)增位點(diǎn)差異有關(guān)，可以考慮結(jié)合植物形態(tài)特征合理分類。

隨著分子標(biāo)記的進(jìn)一步應(yīng)用，將會(huì)有越來越多的標(biāo)記用來改進(jìn)和發(fā)展目前的遺傳連鎖圖譜，圖譜的飽和度會(huì)變得更高，高密度的遺傳連鎖圖譜對(duì)基因的定位克隆和分子輔助育種等都具有重要指導(dǎo)意義。前人已經(jīng)在其它果樹的高密度的連鎖圖譜和與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)分子標(biāo)記開發(fā)利用方面取得了很多可喜的成就，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展前景，這是從事菠蘿研究工作者今后努力的方向。

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