苦豆籽生物堿的提取工藝

李軍+陳海燕+郭鴻雁+等

摘要：探討苦豆籽中生物堿提取的影響因素，并確定最佳的提取條件。通過單因素試驗和正交試驗，研究各種工藝條件（溶劑、料液比、提取時間、溶劑pH值）對苦豆籽生物堿提取率的影響，優(yōu)化其提取工藝。結(jié)果表明：最佳提取條件為55%乙醇作為提取溶劑，料液比為1 g ∶16 mL，提取時間為3 h，溶劑pH值為3.5。研究的提取工藝簡便易行，并有利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

關鍵詞：苦豆籽；生物堿；提取

中圖分類號： Q946.88；R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0250-02

收稿日期：2013-09-12

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2011BA105B04）；寧夏高等學?？茖W技術研究項目（編號：NGY2012125）。

作者簡介：李軍（1982—），男，山西渾源人，碩士，講師，主要從事藥物提取方面的研究。E-mail：lijunamy@126.com。苦豆子（Sophora alopecuroides L.）又稱苦甘草、苦豆根，隸屬于豆科槐屬，為多年生草本、根莖地下芽植物，其分布區(qū)較廣，在我國主產(chǎn)于寧夏、內(nèi)蒙古、山西、陜西、甘肅等地區(qū)[1-2]?？喽棺咽强喽棺拥某墒旆N子，具有清熱解毒、祛風燥濕、止痛殺蟲等作用，廣泛應用于醫(yī)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑、飼料業(yè)等領域[3]。苦豆籽中的生物堿含量約為8.11%，主要含氧化苦參堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐果堿、槐定堿等20多種單一生物堿[4]。目前在臨床上應用苦豆籽浸膏片、苦豆堿治療急性菌痢，用槐定堿和苦豆籽總堿注射液治療腫瘤的研究已經(jīng)進行得較為成功。國內(nèi)外文獻中關于苦豆籽生物堿的報道主要集中在成分分析和檢測[5]，而以苦豆籽作為試驗材料并從中提取生物堿的報道很少，加上常規(guī)提取方法效率低、應用局限性大，因此生產(chǎn)應用價值不高[6]。本研究采用回流提取技術，通過正交試驗法對影響生物堿提取率的因素進行優(yōu)化并選出最佳工藝條件，以期為今后從苦豆籽中獲得生物堿的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學依據(jù)與參考。

1材料與方法

1.1儀器與材料

所用的儀器主要有：TU-1810型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，鄭州南北儀器設備有限公司；AE240電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DKB-8A 電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；130-A 型高速粉碎機，長沙市中南制藥機械廠。

材料與試劑主要有：苦豆籽，采于鹽池縣花馬池鎮(zhèn)德勝墩自然村等地，經(jīng)寧夏藥品檢驗所邢世瑞主任藥師鑒定為豆科槐屬植物苦豆子種子，粉碎過20目篩待用；乙醇、氯仿等化學試劑均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1苦豆籽生物堿含量的測定 苦豆籽總生物堿中含20多種單體，其中以槐定堿的含量最高，因此參考相關文獻，以槐定堿為指標成分，采用溴麝香草酚藍比色法測定苦豆籽總生物堿含量（λ=410 nm）[7]，具體方法如下。

1.2.1.1標準曲線的制作精確稱取5.00 mg槐定堿對照品置于5 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解、稀釋并定容，搖勻即得槐定堿對照液。分別取0、20、40、60、80、100、120、140 μL上述溶液于50 mL的磨口錐形瓶中，使乙醇揮發(fā)后分別加入12 mL pH值為7.6的溴麝香草酚藍緩沖液、12 mL氯仿，密塞劇烈振搖2 min后靜置2 h，分取氯仿層，以第1組為空白對照，于410 nm處測定提取液的吸光度，以吸光度為橫坐標、氯仿層濃度為縱坐標得回歸方程：C=76.92D+0.77，r=0999 0。

1.2.1.2樣品含量的測定分別吸取1 mL定容的提取液并稀釋至100 mL，再吸取1 mL稀釋液至錐形瓶中，分別加入 12 mL pH值為7.6的溴麝香草酚藍緩沖液、12 mL氯仿，密塞振搖2 min后注入酸式滴定管中，靜置2 h，分取氯仿層。以 1 mL 對應的提取溶劑、12 mL pH值為7.6的溴麝香草酚藍緩沖液、12 mL氯仿進行同比操作，設為空白對照，于410 nm處測定提取液的吸光度D，從制作的標準曲線中查得相應的生物堿濃度，計算出苦豆籽總生物堿的含量。

1.2.2最佳提取溶劑的確定準確稱取3份苦豆籽粉，每份25.0 g，在其他條件相同的情況下，分別用200 mL水、0.4%鹽酸、65%乙醇各進行回流提取6 h，過濾后收集濾液并定容至200 mL，用溴麝香草酚藍比色法測定生物堿含量并計算生物堿提取率，確定最佳的提取溶劑。

1.3單因素試驗

1.3.1料液比分別準確稱取4份25.0 g的苦豆籽粉并置于三角瓶中，再分別加入100、200、400、800 mL 65%乙醇，浸泡過夜后將其移至燒瓶中進行回流提取6 h，過濾、定容作為提取液。按照“1.2.1”中苦豆籽生物堿含量測定方法測得生物堿提取率。試驗重復3次，取平均值。

1.3.2提取時間準確稱取5份25.0 g苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，分別各加入200 mL 65%乙醇，浸泡過夜后將其移至燒瓶中分別回流提取2、4、6、8、10 h，過濾，定容作為提取液。按照“1.2.1”中苦豆籽生物堿含量測定方法測得生物堿提取率。試驗重復3次，取平均值。

1.3.3溶劑pH值準確稱取5份25.0 g的苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，分別加入pH值分別為1、2、3、4、5的65%乙醇200 mL，浸泡過夜后，將其移至燒瓶中分別回流提取6 h，過濾，定容作為提取液。按照“1.2.1”中苦豆籽生物堿含量測定方法測得生物堿提取率。試驗重復3次，取平均值。

1.4正交試驗設計

準確稱取9份苦豆籽粉，每份25.0 g，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以料液比、溶劑濃度、溶劑pH值、提取時間這4個因素做正交試驗，設計L9（34）正交試驗。根據(jù)試驗結(jié)果確定最佳的提取條件。endprint

2結(jié)果與分析

2.1最佳提取溶劑的確定

提取溶劑對苦豆籽生物堿提取率的影響見表1，可以看出65%乙醇作為溶劑的提取率較高，達到3.43%，因此選65%乙醇作為溶劑進行回流提取，選擇55%、65%、75%作為正交試驗的3個溶劑濃度。

最佳提取溶劑的確定

溶劑提取率（%）水2.630.4% 鹽酸2.8165% 乙醇3.43

2.2料液比對苦豆籽生物堿提取的影響

料液比對苦豆籽生物堿提取率的影響見圖1，可以看出，提取率隨料液比的增大而增加，當料液比達到1 g ∶16 mL時，苦豆籽中的生物堿基本溶出，隨著溶劑用量的進一步增加，提取率反而會明顯下降。因此選擇料液比1 g ∶16 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶24 mL作為正交試驗的3個考察水平。

2.3提取時間對苦豆籽生物堿提取的影響

隨著提取時間的增加，提取率逐漸增加，其中4 h的提取率最高，而后漸漸降低，綜合考慮提取率和效率，選擇3、4、5 h 3個水平進行正交試驗。

2.4溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響

溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響結(jié)果見圖3，可以看出，苦豆籽生物堿的提取率隨著溶劑pH值的增加有一定的提高，pH值為4時的提取率最高，而后隨著pH值增加，提取率下降。因此選擇pH值3.5、4.0、4. 5作為正交試驗的3個考察水平。

2.5正交試驗結(jié)果

根據(jù)所選取的因素水平，采用L9（34）正交表進行試驗設

計，對結(jié)果進行極差分析試驗結(jié)果表明：4個因素對提取率的影響主次順序為A>D>C>B。得出最佳的提取工藝條件是：A1B3C1D1，其中最優(yōu)的B因素為75%乙醇，但考慮工業(yè)化生產(chǎn)中的安全性及成本，選擇最優(yōu)工藝條件為：A1B1C1D1，即55%乙醇，料液比1 g ∶16 mL，溶劑pH值=35，提取時間3 h。

2.6驗證性試驗

按照以上正交試驗所確定的最佳提取工藝重復提取3次，計算提取率，結(jié)果分別為4.57 %、4.61 %、4.58 %，均大于表3中的提取率，表明以上正交試驗所確定的提取工藝為最佳提取工藝。

3結(jié)論與討論

對苦豆籽生物堿進行吸收波長掃描發(fā)現(xiàn)，其最大吸收波長為410 nm。采用單因素試驗和正交試驗法確定了最佳的提取條件為：料液比1 g ∶16 mL，提取溶劑為55%乙醇，溶劑pH值為3.5，提取時間3 h。工藝驗證試驗表明，最佳工藝的提取得率高、穩(wěn)定性好，且工藝操作容易控制，為進一步放大進行工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件[8]。

筆者在預試驗中考察了用65%乙醇進行超聲、回流、煎煮提取，結(jié)果顯示超聲和回流提取法較煎煮法提取效率高，且超聲提取的提取率最高達4.7%，但是由于超聲提取法在工業(yè)生產(chǎn)中設備較少且較貴，目前較少有工業(yè)化的超聲提取設備，大部分企業(yè)以回流提取為主，故本研究最終確定用回流法提取總生物堿為考察指標對提取工藝進行優(yōu)選，篩選得到的工藝條件經(jīng)驗證表明方法可行、重復性較好[9-10]。

參考文獻：

[1]李春英，胡永強. 苦豆子中生物堿的分布及其在生長期內(nèi)的含量變化[J]. 植物生理學通訊，2009，45（9）：910-912.

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[4]史高峰，張梅，陳學福，等. 正交實驗法優(yōu)選苦豆籽總生物堿的純化工藝[J]. 應用化工，2011，40（10）：1774-1778.

[5]楊巧麗，顧政一，黃華. 中藥苦豆子的研究進展[J]. 西北藥學雜志，2011，26（3）：232-236.

[6]賈曉紅，尚軍，余永婷，等. 苦豆籽中苦參堿的提取條件的優(yōu)化選擇[J]. 食品科技，2005（4）：39-42.

[7]李軍，冷曉紅，郝彩琴. 苦豆草生物堿提取方法的研究[J]. 安徽農(nóng)學通報，2010，16（17）：47-48.

[8]李曉，魏悅，郭唯，等. 連翹葉中連翹苷的提取工藝[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2013，24（4）：843-844.

[9]張志琴，劉光明，楊永壽，等. 正交試驗優(yōu)化云南松松針中莽草酸的提取工藝[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志，2012，32（10）：761-763.

[10]王豐，明哲. 菊芋花色素苷提取工藝的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（6）：250-251.陳華，廖崇靜，馮珊，等. 酸堿處理提取水稻秸稈纖維素的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：252-254.endprint

2結(jié)果與分析

2.1最佳提取溶劑的確定

提取溶劑對苦豆籽生物堿提取率的影響見表1，可以看出65%乙醇作為溶劑的提取率較高，達到3.43%，因此選65%乙醇作為溶劑進行回流提取，選擇55%、65%、75%作為正交試驗的3個溶劑濃度。

最佳提取溶劑的確定

溶劑提取率（%）水2.630.4% 鹽酸2.8165% 乙醇3.43

2.2料液比對苦豆籽生物堿提取的影響

料液比對苦豆籽生物堿提取率的影響見圖1，可以看出，提取率隨料液比的增大而增加，當料液比達到1 g ∶16 mL時，苦豆籽中的生物堿基本溶出，隨著溶劑用量的進一步增加，提取率反而會明顯下降。因此選擇料液比1 g ∶16 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶24 mL作為正交試驗的3個考察水平。

2.3提取時間對苦豆籽生物堿提取的影響

隨著提取時間的增加，提取率逐漸增加，其中4 h的提取率最高，而后漸漸降低，綜合考慮提取率和效率，選擇3、4、5 h 3個水平進行正交試驗。

2.4溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響

溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響結(jié)果見圖3，可以看出，苦豆籽生物堿的提取率隨著溶劑pH值的增加有一定的提高，pH值為4時的提取率最高，而后隨著pH值增加，提取率下降。因此選擇pH值3.5、4.0、4. 5作為正交試驗的3個考察水平。

2.5正交試驗結(jié)果

根據(jù)所選取的因素水平，采用L9（34）正交表進行試驗設

計，對結(jié)果進行極差分析試驗結(jié)果表明：4個因素對提取率的影響主次順序為A>D>C>B。得出最佳的提取工藝條件是：A1B3C1D1，其中最優(yōu)的B因素為75%乙醇，但考慮工業(yè)化生產(chǎn)中的安全性及成本，選擇最優(yōu)工藝條件為：A1B1C1D1，即55%乙醇，料液比1 g ∶16 mL，溶劑pH值=35，提取時間3 h。

2.6驗證性試驗

按照以上正交試驗所確定的最佳提取工藝重復提取3次，計算提取率，結(jié)果分別為4.57 %、4.61 %、4.58 %，均大于表3中的提取率，表明以上正交試驗所確定的提取工藝為最佳提取工藝。

3結(jié)論與討論

對苦豆籽生物堿進行吸收波長掃描發(fā)現(xiàn)，其最大吸收波長為410 nm。采用單因素試驗和正交試驗法確定了最佳的提取條件為：料液比1 g ∶16 mL，提取溶劑為55%乙醇，溶劑pH值為3.5，提取時間3 h。工藝驗證試驗表明，最佳工藝的提取得率高、穩(wěn)定性好，且工藝操作容易控制，為進一步放大進行工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件[8]。

筆者在預試驗中考察了用65%乙醇進行超聲、回流、煎煮提取，結(jié)果顯示超聲和回流提取法較煎煮法提取效率高，且超聲提取的提取率最高達4.7%，但是由于超聲提取法在工業(yè)生產(chǎn)中設備較少且較貴，目前較少有工業(yè)化的超聲提取設備，大部分企業(yè)以回流提取為主，故本研究最終確定用回流法提取總生物堿為考察指標對提取工藝進行優(yōu)選，篩選得到的工藝條件經(jīng)驗證表明方法可行、重復性較好[9-10]。

參考文獻：

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[10]王豐，明哲. 菊芋花色素苷提取工藝的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（6）：250-251.陳華，廖崇靜，馮珊，等. 酸堿處理提取水稻秸稈纖維素的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：252-254.endprint

2結(jié)果與分析

2.1最佳提取溶劑的確定

提取溶劑對苦豆籽生物堿提取率的影響見表1，可以看出65%乙醇作為溶劑的提取率較高，達到3.43%，因此選65%乙醇作為溶劑進行回流提取，選擇55%、65%、75%作為正交試驗的3個溶劑濃度。

最佳提取溶劑的確定

溶劑提取率（%）水2.630.4% 鹽酸2.8165% 乙醇3.43

2.2料液比對苦豆籽生物堿提取的影響

料液比對苦豆籽生物堿提取率的影響見圖1，可以看出，提取率隨料液比的增大而增加，當料液比達到1 g ∶16 mL時，苦豆籽中的生物堿基本溶出，隨著溶劑用量的進一步增加，提取率反而會明顯下降。因此選擇料液比1 g ∶16 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶24 mL作為正交試驗的3個考察水平。

2.3提取時間對苦豆籽生物堿提取的影響

隨著提取時間的增加，提取率逐漸增加，其中4 h的提取率最高，而后漸漸降低，綜合考慮提取率和效率，選擇3、4、5 h 3個水平進行正交試驗。

2.4溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響

溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響結(jié)果見圖3，可以看出，苦豆籽生物堿的提取率隨著溶劑pH值的增加有一定的提高，pH值為4時的提取率最高，而后隨著pH值增加，提取率下降。因此選擇pH值3.5、4.0、4. 5作為正交試驗的3個考察水平。

2.5正交試驗結(jié)果

根據(jù)所選取的因素水平，采用L9（34）正交表進行試驗設

計，對結(jié)果進行極差分析試驗結(jié)果表明：4個因素對提取率的影響主次順序為A>D>C>B。得出最佳的提取工藝條件是：A1B3C1D1，其中最優(yōu)的B因素為75%乙醇，但考慮工業(yè)化生產(chǎn)中的安全性及成本，選擇最優(yōu)工藝條件為：A1B1C1D1，即55%乙醇，料液比1 g ∶16 mL，溶劑pH值=35，提取時間3 h。

2.6驗證性試驗

按照以上正交試驗所確定的最佳提取工藝重復提取3次，計算提取率，結(jié)果分別為4.57 %、4.61 %、4.58 %，均大于表3中的提取率，表明以上正交試驗所確定的提取工藝為最佳提取工藝。

3結(jié)論與討論

對苦豆籽生物堿進行吸收波長掃描發(fā)現(xiàn)，其最大吸收波長為410 nm。采用單因素試驗和正交試驗法確定了最佳的提取條件為：料液比1 g ∶16 mL，提取溶劑為55%乙醇，溶劑pH值為3.5，提取時間3 h。工藝驗證試驗表明，最佳工藝的提取得率高、穩(wěn)定性好，且工藝操作容易控制，為進一步放大進行工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件[8]。

筆者在預試驗中考察了用65%乙醇進行超聲、回流、煎煮提取，結(jié)果顯示超聲和回流提取法較煎煮法提取效率高，且超聲提取的提取率最高達4.7%，但是由于超聲提取法在工業(yè)生產(chǎn)中設備較少且較貴，目前較少有工業(yè)化的超聲提取設備，大部分企業(yè)以回流提取為主，故本研究最終確定用回流法提取總生物堿為考察指標對提取工藝進行優(yōu)選，篩選得到的工藝條件經(jīng)驗證表明方法可行、重復性較好[9-10]。

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