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    4個中藥復方對雞胚成纖維細胞的安全濃度和生長的影響

    2014-08-12 14:45:31邢玉娟陳茜陳玉庫
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2014年6期
    關鍵詞:中藥復方生長

    邢玉娟+陳茜+陳玉庫+等

    摘要:將氧化苦參堿(OM)-黃芪多糖(APS)、OM-APS-梔子苷(GP)、甘草酸(GA)-APS和GA-APS-GP 等4個中藥復方分別用MEM培養(yǎng)液溶解倍比稀釋成1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 μg/mL 等10個濃度,再分別加入到培養(yǎng)24 h且已經(jīng)長成單層雞胚成纖維細胞(CEF)的培養(yǎng)體系中,通過MTT法測定4個中藥復方對雞胚成纖維細胞增殖的影響。結果表明,OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS-GP對CEF的安全濃度均為1 000 μg/mL,GA-APS為500 μg/mL;OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS在500~1.96 μg/mL,GA-APS-GP在500~3.92 μg/mL濃度范圍內(nèi)對CEF生長均有明顯的促進作用,作用最強的是OM-APS-GP,其次是OM-APS、GA-APS和GA-APS-GP。

    關鍵詞:中藥復方;雞胚成纖維細胞;生長;安全濃度

    中圖分類號:S853.74文獻標志碼:A文章編號:1002-1302(2014)06-0149-03

    收稿日期:2013-09-06

    基金項目:國家科技支撐計劃(編號:2008BADB4B06);江蘇青藍工程骨干教師資助項目。

    作者簡介:邢玉娟(1964—),女,山東濟南人,副教授,主要從事中藥藥理研究。E-mail:1903048595@qq.com。

    通信作者:胡元亮,教授,博士生導師,主要從事中獸醫(yī)學研究。E-mail:ylhu@njau.edu.cn。有研究證明,中藥為一種免疫增強劑,具有來源廣泛、效果顯著、無毒副作用等優(yōu)勢,不僅能克服油乳類和鋁膠類化學佐劑副作用大、局部刺激性強、致癌、制備和使用麻煩或不能足夠提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-2],而且能顯著增強機體的細胞免疫和體液免疫功能,促進免疫器官的發(fā)育和細胞因子的分泌[3-4]。

    有試驗證明,氧化苦參堿(oxymatrine,OM)和黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)在先于病毒加入細胞、后于病毒加入細胞和與病毒同時加入細胞等3種方式加入后均能抑制病毒生長,甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)在先于病毒加入和與病毒同時加入時有抑制病毒生長作用,梔子苷(geniposide,GP)只有在先于病毒加入時才能顯現(xiàn)出一定的抑制病毒感染細胞能力的作用[5-6]。本試驗選用體外試驗對雞新城疫病毒(NDV)呈現(xiàn)抑制作用的OM、APS、GP和GA,按一定比例分別組成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等4個中藥復方,通過MTT(四唑溴鹽)法[7-11]測定4個中藥復方對雞胚成纖維細胞(chickembryo fibroblast,CEF)增殖的影響,為下一步體內(nèi)試驗作準備。

    1材料與方法

    1.1試驗藥物

    根據(jù)以前的試驗結果[5],將OM、GA、GP、APS 等4種中藥按一定比例組成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等 4個復方,分別用MEM培養(yǎng)液溶解稀釋成1 000 μg/mL,高壓滅菌,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨用前吸取各藥0.5 mL至24孔細胞培養(yǎng)板第1孔中,加入細胞維持液 0.5 mL,倍比稀釋至10孔。

    1.2主要試劑

    MEM細胞培養(yǎng)液,Gibco公司產(chǎn)品,按說明書配制,再加入犢牛血清(5%為細胞生長液、2%為細胞維持液),再按常規(guī)量加入0.03%谷胺酰氨和雙抗(各100 IU/mL);胰蛋白酶,進口分裝,用PBS(pH值7.4)配制成0.25%的溶液,0.22 μm 混合纖維素酯微孔濾膜過濾除菌,分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆?;MTT溶液,Sigma公司產(chǎn)品,用pH值為7.4的PBS液配制,使終濃度為2 mg/mL,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,分裝,4 ℃冰箱保存,1 周內(nèi)用完;裂解液二甲亞砜(DMSO),分析純,江蘇蘇州工業(yè)園區(qū)正興化工研究院生產(chǎn)。

    1.3主要儀器

    CO2培養(yǎng)箱,美國Revco公司生產(chǎn);XSZ-DZ型倒置顯微鏡,重慶光學儀器廠生產(chǎn);DG3022型酶聯(lián)免疫檢測儀,國營華東電子管廠制造;75-2A型微量振蕩器,上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn);96 孔細胞培養(yǎng)板和24 孔細胞培養(yǎng)板,德國 Nunclon 公司生產(chǎn)。

    1.4試驗方法

    按文獻[12-13]的方法制備CEF。用細胞生長液調(diào)整細胞數(shù)至100萬個/mL,在96 孔細胞培養(yǎng)板中加入 100 μL/孔,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待CEF剛形成單層時加藥。試驗組分別加入不同濃度的中藥復方 100 μL/孔,每個濃度重復4 孔,每2種中藥成分復方共用一塊細胞板并重復2塊細胞板;對照組4 孔,僅加細胞維持液;另設無細胞孔為測定時的空白調(diào)零孔,繼續(xù)培養(yǎng)。加藥后 48 h 測定細胞增殖情況。

    1.5細胞增殖測定

    用MTT法測定細胞增殖的情況:測定前4 h加入 50 μL/孔 MTT溶液;測定時快速翻轉培養(yǎng)板,甩去孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入100 μL/孔裂解液,室溫下振蕩5 min使結晶物溶解;然后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定D570 nm,作為細胞增殖的指標。D570 nm與活細胞的增殖呈正比,即D570 nm越大,細胞增殖越旺盛。

    1.6中藥對CEF安全濃度的判定

    根據(jù)D570 nm測定結果判定中藥對CEF的安全濃度,選擇D570 nm與對照差異不顯著的試驗組的最高中藥濃度作為安全濃度的上限[14]。

    1.7數(shù)據(jù)處理

    計算4 孔平均值和標準差,數(shù)據(jù)以“x±s”表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和多重比較,并比較各中藥組分對CEF增殖率的差異性。增殖率=(各組加藥后的D570 nm-對照的D570 nm)/對照的D570 nm×100%。

    2結果與分析

    2.14個中藥復方對CEF增殖的影響

    3.91~31.25 μg/mL OM-APS 的D570 nm顯著高于對照(P<0.05),1.95、62.50~500.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm高于對照但不顯著(P>0.05),1 000.00 μg/mL OM-APS的D570 mm低于對照但不顯著(P>0.05)。說明OM-APS濃度在3.91~3125 μg/mL時對細胞增殖有顯著的促進作用。綜合以上結果可知,OM-APS的最大安全濃度為1 000.00 μg/mL(表1)。表14個中藥復方對CEF增殖的影響

    濃度

    (μg/mL)D570 nmOM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.000.305±0.005d0.313±0.015c0.332±0.009e0.325±0.020d500.000.345±0.051bc0.367±0.015b0.365±0.019cd0.372±0.017bc250.000.370±0.014abc0.388±0.013ab0.365±0.012cd0.375±0.023bc125.000.370±0.008abc0.387±0.006ab0.366±0.015cd0.388±0.017ab62.500.373±0.015abc0.383±0.015ab0.380±0.010abcd0.412±0.009a31.250.380±0.01ab0.380±0.010ab0.376±0.015bcd0.392±0.005ab15.620.380±0.010ab0.400±0.010a0.386±0.015abc0.382±0.026abc7.810.382±0.020ab0.370±0.010b0.403±0.005a0.360±0.008bc3.910.393±0.017a0.380±0.010ab0.400±0.008ab0.372±0.017bc1.950.372±0.012abc0.366±0.005b0.375±0.012bcd0.347±0.053cd對照0.336±0.028cd0.336±0.028c0.356±0.022d0.356±0.022bcd注:同列數(shù)據(jù)后不同字母者表示差異顯著(P<0.05)。

    1.95~500.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm均顯著高于對照,1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm低于對照但不顯著(P>0.05)。說明OM-APS-GP在1.95~500.00 μg/mL 時對細胞增殖有促進作用,OM-APS-GP的最大安全濃度為1 000 μg/mL(表1)。

    3.91~15.62 μg/mL GA-APS的D570 nm顯著高于對照(P<0.05),1 000.00 μg/mL GA-APS的 D570 nm顯著低于對照,1.95、31.25~500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于對照但不顯著(P>0.05)。說明GA-APS在3.91~15.62 μg/mL能顯著促進細胞增殖,但隨濃度升高,促進增殖作用逐漸減弱,1 000.00 μg/mL 對細胞增殖有抑制作用。綜合以上結果可知,GA-APS最大安全濃度為500.00 μg/mL(表1)。

    62.50 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm顯著高于對照(P<0.05),125.00~500.00、3.91~31.25 μg/mL 的 D570 nm高于對照但不顯著(P>0.05),1.95、1 000.00 μg/mL 的 D570 nm 低于對照但不顯著。說明62.50 μg/mL GA-APS-GP對細胞增殖有顯著的促進作用,且隨濃度的升高或降低,促進增殖作用逐漸減弱。綜合以上結果可知,GA-APS-GP最大安全濃度為1 000.00 μg/mL(表1)。

    2.24個復方對CEF增殖率的影響

    對CEF增殖率最高的是OM-APS-GP,當其濃度為 15.62 μg/mL 時增殖率達到19.05%。OM-APS有8個濃度、OM-APS-GP有7個濃度、GA-APS和GA-APS-GP各有2個濃度使CEF增殖率達到了10%以上(表2)。

    OM-APS促進CEF生長的作用曲線呈馬鞍形,有2個峰值,分別是3.91、250.00 μg/mL;OM-APS-GP的促生長曲線呈駝峰形,有3個峰值,分別是3.91、15.62、250.00 μg/mL;GA-APS的促生長曲線呈駝峰形,有3個峰值,分別是7.81、62.50、500.00 μg/mL;GA-APS-GP 的促生長曲線呈單峰狀,在62.50 μg/mL達到峰值。

    表24個中藥復方對CEF增殖率的影響

    濃度

    (μg/mL)增殖率(%)OM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.00-9.23-6.85-6.74-8.71500.002.689.232.534.49250.0010.1215.482.535.34125.0010.1215.182.818.9962.5011.0113.996.7415.7331.2513.1013.105.6210.1115.6213.1019.058.437.307.8113.6910.1213.201.123.9116.9613.1012.364.491.9510.718.935.34-2.53對照0000

    3結論與討論

    3.1中藥復方對CEF的安全濃度

    根據(jù)D570 nm測定結果可知,1 000.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm低于對照但不顯著(P>0.05);500.00~1.95 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm均顯著高于對照(P<005),1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm低于對照但不顯著(P>0.05);500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于對照但不顯著(P>0.05),1 000.00 μg/mL GA-APS的D570 nm顯著低于對照(P<0.05);500.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm高于對照但不顯著(P>0.05),1 000.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm低于對照但不顯著。綜合以上結果可知,OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS、GA-APS-GP 對CEF的安全濃度分別為1 000.00、1 000.00、500.00、1 000.00 μg/mL。

    3.2中藥復方對CEF增殖的影響

    D570 nm能直接反映被測樣品中活細胞的增殖情況,兩者呈正相關。本試驗中3.91~31.25 μg/mL OM-APS、1.95~500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91~15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm顯著高于對照(P<0.05),說明這4個中藥復方在一定的濃度范圍內(nèi)均能促進CEF增殖。其中,OM-APS-GP促進CEF增殖的濃度范圍最大,所選濃度范圍對細胞生長均無抑制作用。綜合增殖率和D570 nm 結果可知,這4 個中藥復方促進CEF增殖作用的強弱依次為OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

    3.3中藥復方促進CEF生長的量效關系

    從試驗結果還可以看出,4個中藥復方在高濃度(1 000.00 μg/mL)時對細胞生長均起抑制作用,隨著濃度的降低,表現(xiàn)出促進生長的作用,但這種促進增殖的作用在達到峰值后又逐漸減弱,說明中藥復方促進細胞增殖要有合適的濃度[15]。

    本試驗中OM-APS有8 個濃度、OM-APS-GP有7 個濃度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 個濃度對CEF增殖率達到了10%以上,在前面的試驗中,APS、OM、GA和GP只有GA有2 個濃度達到10%以上,說明復方促進細胞生長作用優(yōu)于單體,發(fā)揮了協(xié)同作用,這和王德云等的研究結果[16-17]一致。

    參考文獻:

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    3.2中藥復方對CEF增殖的影響

    D570 nm能直接反映被測樣品中活細胞的增殖情況,兩者呈正相關。本試驗中3.91~31.25 μg/mL OM-APS、1.95~500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91~15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm顯著高于對照(P<0.05),說明這4個中藥復方在一定的濃度范圍內(nèi)均能促進CEF增殖。其中,OM-APS-GP促進CEF增殖的濃度范圍最大,所選濃度范圍對細胞生長均無抑制作用。綜合增殖率和D570 nm 結果可知,這4 個中藥復方促進CEF增殖作用的強弱依次為OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

    3.3中藥復方促進CEF生長的量效關系

    從試驗結果還可以看出,4個中藥復方在高濃度(1 000.00 μg/mL)時對細胞生長均起抑制作用,隨著濃度的降低,表現(xiàn)出促進生長的作用,但這種促進增殖的作用在達到峰值后又逐漸減弱,說明中藥復方促進細胞增殖要有合適的濃度[15]。

    本試驗中OM-APS有8 個濃度、OM-APS-GP有7 個濃度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 個濃度對CEF增殖率達到了10%以上,在前面的試驗中,APS、OM、GA和GP只有GA有2 個濃度達到10%以上,說明復方促進細胞生長作用優(yōu)于單體,發(fā)揮了協(xié)同作用,這和王德云等的研究結果[16-17]一致。

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    3.2中藥復方對CEF增殖的影響

    D570 nm能直接反映被測樣品中活細胞的增殖情況,兩者呈正相關。本試驗中3.91~31.25 μg/mL OM-APS、1.95~500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91~15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm顯著高于對照(P<0.05),說明這4個中藥復方在一定的濃度范圍內(nèi)均能促進CEF增殖。其中,OM-APS-GP促進CEF增殖的濃度范圍最大,所選濃度范圍對細胞生長均無抑制作用。綜合增殖率和D570 nm 結果可知,這4 個中藥復方促進CEF增殖作用的強弱依次為OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

    3.3中藥復方促進CEF生長的量效關系

    從試驗結果還可以看出,4個中藥復方在高濃度(1 000.00 μg/mL)時對細胞生長均起抑制作用,隨著濃度的降低,表現(xiàn)出促進生長的作用,但這種促進增殖的作用在達到峰值后又逐漸減弱,說明中藥復方促進細胞增殖要有合適的濃度[15]。

    本試驗中OM-APS有8 個濃度、OM-APS-GP有7 個濃度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 個濃度對CEF增殖率達到了10%以上,在前面的試驗中,APS、OM、GA和GP只有GA有2 個濃度達到10%以上,說明復方促進細胞生長作用優(yōu)于單體,發(fā)揮了協(xié)同作用,這和王德云等的研究結果[16-17]一致。

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